冷休克條件促進紅色半胱氨酸脫硫酶形成的機制及其生理學意義的研究.pdf

1、目的：
　　半胱氨酸脫硫酶是一類依賴磷酸吡哆醛的同質(zhì)二聚體酶，能夠催化底物L-半胱氨酸脫硫生成L-丙氨酸及酶過硫化物中間物。大腸桿菌半胱氨酸脫硫酶IscS因含有輔因子PLP通常呈現(xiàn)黃色。本實驗在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)缺鐵環(huán)境和大腸桿菌雙敲除菌E.coli iscA-sufA-MC4100中過表達的IscS蛋白顏色為紅色的基礎上，發(fā)現(xiàn)嵌合型半胱氨酸脫硫酶EH-IscS在15℃冷休克培養(yǎng)條件下過表達時也為紅色，且進一步發(fā)現(xiàn)富營養(yǎng)化培養(yǎng)基聯(lián)

2、合冷休克培養(yǎng)條件可以產(chǎn)生在528 nm處具有明顯特征性吸收峰的紅色IscS。本實驗通過分析冷休克條件下大腸桿菌鐵硫簇組裝水平變化、培養(yǎng)基成分改變對紅色蛋白累積的影響以及黃色與紅色蛋白的活性差異，以探究冷休克條件下產(chǎn)生的紅色半胱氨酸脫硫酶形成的原因及生理意義。
　　方法：
　　1．構建一種新的大腸桿菌冷休克助溶型表達質(zhì)粒pCold-SUMOa
　　以pE-SUMOproKan質(zhì)粒為模板，采用SUMO-F/R引物擴增獲得S

3、UMO基因編碼框片段。以pCold TF質(zhì)粒為模板，采用pCold-F/R引物擴增pCold質(zhì)粒骨架片段。采用無縫克隆技術將上述兩個片段連接獲得重組質(zhì)粒pCold-SUMOa。
　　2．表達半胱氨酸脫硫酶重組質(zhì)粒的構建
　　(1)、構建表達大腸桿菌半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒
　　以大腸桿菌E.coli MC4100基因組為模板，擴增IscS編碼框基因。Kpn I單酶切pCold I質(zhì)粒，然后采用無縫克隆技術構建獲得重組質(zhì)

4、粒IscS-pCold I。
　　(2)、構建表達人源半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒
　　以NFS1(55-457)-pET28b質(zhì)粒為模板擴增獲得含有編碼人源半胱氨酸脫硫酶55-457位氨基酸的基因序列，pCold I、pCold-GST、pCold-SUMOa和pCold TF質(zhì)粒單酶切后并膠回收酶切后載體片段。然后用無縫克隆技術將NFS1基因連接至單酶切后載體片段中，獲得NFS1-pCold I, NFS1-pCold-SU

5、MOa, NFS1-pCold-GST和NFS1-pCold TF重組質(zhì)粒。
　　(3)、構建表達嵌合型半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒
　　以EH-IscS-pET28質(zhì)粒為模板擴增獲得EH-IscS基因， pCold I, pCold-GST， pCold-SUMOa和pCold TF質(zhì)粒單酶切后膠回收，采用無縫克隆技術分別將EH-IscS基因連接至上述四個單酶切后載體片段中，獲得 EH-IscS-pCold I, EH-Isc

6、S-pCold-GST, EH-IscS-pCold TF, EH-IscS-pCold-SUMOa重組表達質(zhì)粒。
　　(4)、構建EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa和EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa突變質(zhì)粒
　　根據(jù)突變位點處的序列分別設計5′端包含互補同源臂序列的正向和反向突變引物，利用基于體外同源重組的無縫克隆技術的基因定點突變方法，構建EH-IscS蛋白的第206位賴氨酸突變?yōu)楸?/p>

7、氨酸的EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa重組質(zhì)粒和第328位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸的EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa重組質(zhì)粒，含有突變位點的重組質(zhì)粒送上海華大基因測序。
　　3.重組半胱氨酸脫硫酶的純化與分析(1)重組半胱氨酸脫硫酶的分離與純化
　　15℃培養(yǎng)條件下誘導表達 IscS, EH-IscS, GST-EH-IscS, TF-EH-IscS, TF-NFS1(55-457), S

8、UMO-NFS1(55-457), SUMO-EH-IscS蛋白，經(jīng)Ni柱親和層析純化和 G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進行全波長掃描分析和SDS-PAGE電泳分析。
　　(2)重組半胱氨酸脫硫酶活性的測定
　　將純化好的蛋白樣品與L-半胱氨酸、DTT在37℃條件下進行孵育，IscS可催化底物L-半胱氨酸脫硫，在DTT存在的條件下形成不穩(wěn)定的硫化氫，硫化氫與FeCl3相互作用，在DPD作為顯色劑的情況下生成藍色絡合

9、物在669nm處有特異的吸收峰，利用公式及硫的消光系數(shù)可得出蛋白中硫的含量，硫含量的多少可以直接反映蛋白活性的高低。
　　(3)重組半胱氨酸脫硫酶穩(wěn)定性的分析
　　使DB將純化好的IscS, EH-IscS, GST-EH-IscS, SUMO-EH-IscS和TF-EH-IscS蛋白濃度分別稀釋為1μM，37℃孵育30 min，每隔5min測定蛋白樣品在320 nm處的吸光值。如果蛋白樣品會發(fā)生自我凝集，320nm處吸光值

10、就會隨著時間的延長而遞增。
　　4.15℃冷休克培養(yǎng)條件下大腸桿菌體內(nèi)IscS紅色中間物的累積分析
　　IscS, EH-IscS, SUMO-EH-IscS, TF-EH-IscS蛋白在15℃條件下分別誘導24h、48h、72h，收集的菌體破碎后經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進行全波長掃描分析和SDS-PAGE電泳分析。
　　5.冷休克培養(yǎng)條件下，鐵螯合劑對紅色反應物生成的影響分析

11、r>　　IscS-pCold I/BL21(DE3)菌體在37℃條件下培養(yǎng)至OD值為0.3-0.4時，加入鐵螯合劑，15℃靜置30min，加入IPTG誘導劑，15℃培養(yǎng)條件下誘導培養(yǎng)24h，蛋白質(zhì)經(jīng)Ni柱親和脫鹽純化。純化后的蛋白用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描分析，并進行SDS-PAGE電泳分析。
　　6.冷休克培養(yǎng)條件對大腸桿菌中[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇組裝的影響分析
　　Nth-pBAD/E. col

12、i BL21(DE3), SoxR-pBAD/E. coli BL21(DE3)蛋白在37℃和25℃培養(yǎng)條件下誘導表達；Nth-pCold I/E. coli BL21(DE3), SoxR-pCold I/E. coli BL21(DE3)在25℃和15℃培養(yǎng)條件下誘導表達。蛋白質(zhì)經(jīng)Ni柱親和脫鹽純化。純化后的蛋白用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描分析，并進行SDS-PAGE電泳分析。
　　7.15℃冷休克培養(yǎng)條件下鐵硫簇組裝

13、相關基因的缺失對紅色反應物生成的影響分析
　　在15℃冷休克培養(yǎng)條件下，通過在存在不同程度鐵硫簇組裝障礙的大腸桿菌突變菌△iscU、△isc和△iscA△sufA中誘導表達IscS，經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進行全波長掃描和SDS-PAGE電泳分析。
　　8.富營養(yǎng)化培養(yǎng)基聯(lián)合冷休克條件對大腸桿菌紅色反應物產(chǎn)生的影響
　　在15℃和25℃培養(yǎng)條件下，用不同的培養(yǎng)基誘導表達IscS蛋白

14、，經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進行全波長掃描分析和SDS-PAGE電泳分析。
　　9.紅色反應物穩(wěn)定性的分析
　　IscS-pBAD/E. coli BL21(DE3)在37℃條件下誘導表達，IscS-pCold I/E. coli BL21(DE3)用含有0.4mM2,2-dipyridyl的LB培養(yǎng)基在15℃條件下誘導表達，然后分別將純化出來的黃色和紅色IscS與10mM L-半胱氨酸在

15、4℃孵育20min，之后進行全波長掃描；在反應體系中加入DTT，然后對蛋白進行全波長掃描分析。
　　10.紅色反應物與半胱氨酸脫硫酶活性的關系分析
　　突變蛋白 IscS-pBAD-K206A/BL21(DE3)， IscS-pBAD-C328S/BL21(DE3), EH-IscS-K206A-pCold-SUMOa/BL21(DE3)， EH-IscS-C328S--pCold-SUMOa/BL21(DE3)在15℃培養(yǎng)

16、條件下誘導表達并純化，用紫外-可見分光光度計進行全波長掃描分析。
　　11.紅色IscS蛋白與黃色IscS蛋白活性的比較
　　誘導的紅色IscS和黃色IscS與PLP（終濃度為200μM）室溫孵育1 h，脫鹽去除剩余的PLP，然后取等摩爾濃度的黃色和紅色IscS(10μM)檢測兩者的半胱氨酸脫硫酶活性。
　　結果：
　　1.表達半胱氨酸脫硫酶重組質(zhì)粒的構建
　　利用無縫克隆和菌落PCR技術，我們成功地構建了

17、冷休克助溶型表達載體pCold-SUMOa，表達大腸桿菌半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒IscS-pCold I，表達人源半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì) NFS1-pColdI, NFS1-pCold-SUMOa, NFS1-pCold-GST, NFS1-pCold TF，表達嵌合型半胱氨酸脫硫酶的重組質(zhì)粒EH-IscS-pColdI, EH-IscS-pCold-GST, EH-IscS-pColdTF, EH-IscS-pCold-SUMOa,突

18、變重組質(zhì)粒 EH-IscS(K206A)-pCold-SUMOa, EH-IscS(C328S)-pCold-SUMOa，并且測序結果也顯示以上重組質(zhì)粒構建成功。
　　2.重組半胱氨酸脫硫酶蛋白的純化與分析
　　SDS-PAGE分析表明純化獲得的重組半胱氨酸脫硫酶的蛋白純度都高于90％。構建的冷休克助溶表達載體pCold-SUMOa可以提高EH-IscS蛋白的可溶性、穩(wěn)定性和活性。且發(fā)現(xiàn)15℃冷休克條件下誘導表達的EH-Is

19、cS為淡紅色，全波長掃描可以看到在528nm處有微弱的特征性吸收峰。
　　3.冷休克培養(yǎng)條件下紅色半胱氨酸脫硫酶會在大腸桿菌體內(nèi)累積
　　15℃條件下誘導表達的IscS, EH-IscS, SUMO-EH-IscS, TF-EH-IscS蛋白目的條帶單一，且發(fā)現(xiàn)隨著誘導時間的增加蛋白顏色逐漸由黃變紅，且在528nm處的特征性吸收峰也逐漸升高。
　　4.冷休克條件可以促進缺鐵環(huán)境中紅色IscS的產(chǎn)生
　　15℃冷休

20、克條件下，在普通LB培養(yǎng)基中加入0.1mM的鐵螯合劑dipyridyl即可使誘導表達IscS蛋白變紅，且隨著dipyridyl濃度的增加蛋白紅色加深，528nm處的吸收峰也逐漸上升。
　　5.冷休克條件下紅色反應物的產(chǎn)生與大腸桿菌中鐵硫簇組裝障礙有關
　　誘導表達純化的Nth-[4Fe-4S]和SoxR-[2Fe-2S]蛋白進行全波長掃描，分析發(fā)現(xiàn)25℃培養(yǎng)條件會抑制抑制大腸桿菌[4Fe-4S]簇的組裝，而不抑制[2Fe-2

21、S]簇的組裝，15℃培養(yǎng)條件下，大腸桿菌[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇的組裝均受到抑制。在15℃冷休克培養(yǎng)條件下，從存在不同程度鐵硫簇組裝障礙的大腸桿菌突變菌△iscU、△isc和△iscA△sufA中純化的IscS都呈紅色，且在528nm處也出現(xiàn)了特征性的吸收峰。
　　6.2× LB和1×TB培養(yǎng)基聯(lián)合15℃冷休克培養(yǎng)條件，都會促進紅色IscS的產(chǎn)生
　　25℃條件下，2× LB和1× TB培養(yǎng)基誘導純化出來的大腸

22、桿菌IscS均為黃色，而15℃條件下誘導的大腸桿菌IscS卻為紅色，且有528nm處的特征性吸收峰。發(fā)現(xiàn)15℃條件下只有增加培養(yǎng)基中酵母膏的含量才會促進大腸桿菌紅色IscS的產(chǎn)生。
　　7.紅色反應物穩(wěn)定性的分析
　　將大腸桿菌IscS與L-半胱氨酸在體外孵育會導致IscS在395 nm處吸收峰消失，而紅色IscS在528 nm處吸收峰卻沒有變化；當在反應體系中加入DTT以后，隨著酶促反應的進行，紅色IscS在528 nm處

23、吸收峰也沒有變化。
　　8.紅色反應物的生成依賴蛋白的活性且紅色反應物會抑制半胱氨酸脫硫酶的活性
　　全波長掃描結果發(fā)現(xiàn)純化的含突變位點的蛋白均呈黃色，也無528nm的特征性吸收峰；且當冷休克條件下表達的紅色IscS和野生型黃色IscS具有相同濃度和PLP結合量的情況下，發(fā)現(xiàn)紅色蛋白的活性明顯低于黃色蛋白。
　　結論：
　　1.構建的冷休克助溶型表達質(zhì)粒pCold-SUMOa能夠提高重組蛋白質(zhì)EH-IscS的溶解

24、度、活性和穩(wěn)定性；
　　2.發(fā)現(xiàn)在15℃冷休克培養(yǎng)條件下表達的重組半胱氨酸脫硫酶EH-IscS為淡紅色，且隨著時間的增加紅色反應物會在大腸桿菌體內(nèi)累積，冷休克培養(yǎng)條件可以促進紅色蛋白的產(chǎn)生；
　　3.25℃培養(yǎng)條件會抑制大腸桿菌[4Fe-4S]簇的組裝，而不抑制[2Fe-2S]簇的組裝，15℃培養(yǎng)條件下大腸桿菌[4Fe-4S]簇和[2Fe-2S]簇的組裝均受到抑制，冷休克條件下，鐵硫簇組裝障礙的大腸桿菌突變菌純化的IscS都

25、呈紅色，說明冷休克條件下該紅色物質(zhì)的產(chǎn)生與鐵硫簇組裝障礙有關；
　　4.2× LB和1× TB培養(yǎng)基聯(lián)合15℃冷休克培養(yǎng)條件，都會促進紅色IscS的累積，并且進一步發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中只有增加酵母膏含量才會促進紅色IscS的累積；5.15℃冷休克條件下表達的含突變位點的蛋白沒有變紅也無528nm吸收峰，說明該紅色反應物與蛋白的活性相關，只有有活性的蛋白才會有紅色物質(zhì)的產(chǎn)生；6.生理狀態(tài)下，紅色中間產(chǎn)物一旦形成就會穩(wěn)定存在；當紅色IscS和