紅色半胱氨酸脫硫酶IscS在大腸桿菌雙敲除菌iscA-sufA-中形成的原因分析.pdf

1、目的:
　　半胱氨酸脫硫酶IscS在野生型MC4100中表達時因含有輔因子磷酸吡哆醛而為黃色，但在雙敲除菌iscA-sufA-中表達則為紅色。IscS可以催化底物L(fēng)-半胱氨酸脫硫形成L-丙氨酸和硫，并在催化過程中形成7種中間產(chǎn)物。iscA和sufA敲除后，細胞中的鐵硫簇組裝中斷，導(dǎo)致IscS催化產(chǎn)生硫和L-丙氨酸的累積，引發(fā)酶促反應(yīng)逆反應(yīng)導(dǎo)致IscS的中間產(chǎn)物的累積。本實驗通過在缺鐵環(huán)境中表達蛋白并進行光譜學(xué)及酶活測定等方面的分析

2、，對該紅色物質(zhì)進行鑒定并分析其形成原因。
　　方法:
　　1.鐵硫簇組裝障礙環(huán)境的模擬
　　(1)、蛋白的純化表達和純化
　　通過在普通LB培養(yǎng)基中加入鐵螯合劑Bipyridine的方法，使細菌處于缺鐵的生長環(huán)境中。E.coli MC4100(Nth-[4Fe-4S])和MC4100(SoxR-[2Fe-2S])分別在正常LB和缺鐵LB中誘導(dǎo)表達。蛋白質(zhì)經(jīng)Ni柱親和脫鹽純化。純化后的蛋白用紫外-可見分光光度計進行

3、全波長掃描分析，并進行SDS-PAGE電泳分析。
　　(2)、蛋白鐵、硫含量的測定
　　采用菲噦嗪法測定蛋白中的鐵含量:在L-cysteine的作用下，蛋白樣品中鐵釋放出來并與菲噦嗪(Ferrozine)結(jié)合形成Fe-Ferrozine絡(luò)合物，在564nm處具有特征性吸收峰，其消光系數(shù)為27.9mM-1cm-1，利用公式CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9（單位:μM）求得鐵含量。
　　采用DPD法測

4、定蛋白中的硫含量:硫化物與FeCl3相互作用，DPD(N-diethyl-p-phenylenediamie)作為顯色劑，可在669nm處形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系數(shù)即可算得蛋白中的硫含量。由于硫的消光系數(shù)不穩(wěn)定，以Nth（一種穩(wěn)定的[4Fe-4S]）為陽性對照，并以Nth計算硫的消光系數(shù)。根據(jù)公式計算硫含量:CS=(OD669-OD800)*1000/S消光系數(shù)（單位:μM） S消光系數(shù)=(OD669-OD800)*100

5、0/Nth CSNth CS=Nth CFe=(OD564-OD700)*1000/27.9
　　2.有氧及厭氧條件下IscS蛋白的表達純化及分析
　　將IscS/MC4100和IscS/ iscAsufA-分別在正常及缺鐵LB中培養(yǎng)至OD達到0.6，加入誘導(dǎo)劑L-阿拉伯糖前向一組中通入氬氣并保持無氧狀態(tài)。分別在有氧和無氧狀態(tài)下誘導(dǎo)表達蛋白，經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進行全波長掃描分析和S

6、DS-PAGE電泳分析。
　　3.缺鐵環(huán)境下突變型IscS蛋白的表達純化及分析
　　(1)、蛋白的純化表達和純化
　　突變型IscS(K206A/MC4100,C328S/MC4100,K206AC328S/MC4100)分別在正常LB和缺鐵LB中進行誘導(dǎo)表達并純化。
　　(2)、蛋白的活性測定
　　將純化的半胱氨酸脫硫酶IscS與L-cysteine、DTT在37℃條件下進行孵育，IscS可催化底物L(fēng)-c

7、ysteine脫硫，在DTT存在的條件下形成H2S，H2S與FeCl3相互作用，DPD(N-diethyl-p-phenylenediamie)作為顯色劑，可在669nm處形成特征性吸收峰，利用公式及硫的消光系數(shù)即可算得蛋白中的硫含量，硫含量的多少可以直接反映IscS活性的大小。
　　4.醌型物質(zhì)在體內(nèi)的累積及純化
　　IscS/iscA-sufA-在有氧條件下正常LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD達到0.6，加入L-阿拉伯糖進行誘導(dǎo)，

8、每1小時收集菌體一次，共收集4次。收集的菌體破碎后經(jīng)Ni柱親和層析純化和G-25脫鹽以獲取目的蛋白。純化后的蛋白進行全波長掃描分析和SDS-PAGE電泳分析。
　　5.醌型物質(zhì)在體外的消除--IscS與氧化劑H2O2的反應(yīng)
　　純化后的IscS/MC4100和IscS/iscAsufA-蛋白分別與不同濃度的H2O2反應(yīng)，4℃孵育30min后，離心并進行全波長掃描分析。
　　結(jié)果:
　　1.缺鐵環(huán)境中Nth和Sox

9、R鐵硫簇組裝發(fā)生障礙
　　純化后的蛋白在23.56KDa和17.15KDa的位置各有目的條帶產(chǎn)生;全波長掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺鐵LB中誘導(dǎo)表達的Nth其鐵硫簇的吸收峰(419nm)下降，SoxR的3個鐵硫簇的吸收峰(414nm、448nm、548nm)也明顯下降;鐵、硫含量測定發(fā)現(xiàn)缺鐵LB中純化出的蛋白其鐵、硫含量均發(fā)生來了明顯下降，說明在缺鐵LB中[4Fe-4S]和[2Fe-2S]的組裝發(fā)生了障礙;
　　2.缺鐵時在有氧及厭氧條件

10、下都能在大腸桿菌細胞中形成紅色IscS
　　分別在有氧和無氧及正常LB和缺鐵LB中誘導(dǎo)表達IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白。純化后的蛋白在46.5KDa位置有目的條帶產(chǎn)生;全波長掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)在有氧且正常的LB培養(yǎng)基中，只有IscS/iscA-sufA-蛋白出現(xiàn)了紅色和528nm的特異性吸收峰;在有氧并缺鐵的LB培養(yǎng)基中，IscS/iscA-sufA-蛋白紅色加深且528nm的特異性吸收峰增高，同時IscS

11、/MC4100也出現(xiàn)了紅色和528nm的特異性吸收峰;在厭氧且正常的LB培養(yǎng)基中，IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白均無紅色和528nm的特異性吸收峰;在厭氧且缺鐵的LB培養(yǎng)基中，IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白均出現(xiàn)紅色和528nm的特異性吸收峰。
　　3.點突變K206A，C328S，K206A/C328S在缺鐵及正常LB中均不能形成紅色IscS
　　純化后的蛋白在46.

12、5KDa位置有目的條帶產(chǎn)生;全波長掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有野生型IscS缺鐵LB中誘導(dǎo)出紅色蛋白并具有528nm的特征性吸收峰，突變后的蛋白在缺鐵LB中均無紅色物質(zhì)產(chǎn)生，也無528nm的特征性吸收峰;活性測定發(fā)現(xiàn)只有野生型IscS具有活性，突變后的蛋白均無活性。
　　4.有氧條件下IscS中醌型物質(zhì)在細胞內(nèi)的累積
　　純化后的蛋白在46.5KDa位置有單一目的條帶產(chǎn)生;肉眼觀察蛋白發(fā)現(xiàn)隨時間的增加，蛋白的顏色逐漸加深;全波長掃描結(jié)果

13、發(fā)現(xiàn)隨時間的增加，蛋白在528nm處的特征性吸收峰也逐漸上升。
　　5.醌型物質(zhì)在體外可被H2O2消除
　　在IscS/MC4100和IscS/iscA-sufA-蛋白中分別加入不同濃度的H2O2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IscS/iscA-sufA-蛋白原有的528nm特征性吸收峰隨H2O2濃度的增加而降低甚至消失。
　　結(jié)論:
　　1.在正常的LB中加入鐵的螯合劑Bipy，可以模擬IscS/iscA-sufA-中的供鐵障礙及

14、鐵硫簇組裝障礙的環(huán)境;
　　2.有氧條件下缺鐵LB中IscS/MC4100出現(xiàn)紅色物質(zhì)的累積說明該紅色物質(zhì)是由于供鐵障礙引起，厭氧條件下正常LB中均無紅色物質(zhì)產(chǎn)生，而缺鐵LB中又都出現(xiàn)紅色物質(zhì)的累積，說明在雙敲菌中該紅色物質(zhì)的產(chǎn)生是由于IscS/SufA的缺失引起;
　　3.突變型IscS蛋白活性消失，且在缺鐵LB中不能產(chǎn)生紅色物質(zhì)，說明該紅色物質(zhì)的產(chǎn)生與蛋白的活性相關(guān)，只有有活性的蛋白才會有紅色物質(zhì)的累積;
　　4.