梗阻性黃疸大鼠胸主動(dòng)脈BKCa和KATP通道過(guò)度激活導(dǎo)致血管低反應(yīng)性.pdf

1、背景與目的:全身血管對(duì)舒、縮血管的活性藥物反應(yīng)減弱或不反應(yīng)即被定義為血管低反應(yīng)性，主要表現(xiàn)為血管舒縮功能障礙以及頑固性低血壓。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，圍術(shù)期梗阻性黃疸(OJ)病人也存在著周?chē)茏枇ο陆担獕合陆?，以及血管?duì)內(nèi)源性和外源性升壓物質(zhì)反應(yīng)不敏感的情況，其具體機(jī)制目前仍不清楚。受體減敏、內(nèi)環(huán)境紊亂、血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)膜超極化等均被認(rèn)為是潛在機(jī)制。血管張力主要由血管平滑肌進(jìn)行調(diào)節(jié)，而其中鉀通道的功能對(duì)于調(diào)節(jié)血管平滑肌的舒縮節(jié)

2、律至關(guān)重要。分布在血管平滑肌細(xì)胞上的鉀通道主要有四個(gè)亞型:Kv（電壓依賴(lài)性鉀通道）、KATP（三磷酸腺苷敏感鉀通道）、Kir（內(nèi)向整流鉀通道）、KCa（鈣激活鉀通道），其中又以BKCa（大電導(dǎo)鈣激活鉀通道）、KATP通道的發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用并且常作為各種內(nèi)（外）源性血管收縮舒張調(diào)節(jié)機(jī)制的作用靶點(diǎn)，故本研究擬在離體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平以及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)水平分別探究梗阻性黃疸大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞上鉀通道是否存在結(jié)構(gòu)或功能上的改變，并探討該種改變對(duì)于

3、梗阻性黃疸大鼠血管收縮和舒張功能的影響、及其與梗阻性黃疸血管低反應(yīng)性之間的聯(lián)系。
　　內(nèi)容與方法:首先選取雄性Sprague-Dawley大鼠建立膽管結(jié)扎(BDL)模型，麻醉后分別取3、7、14天組BDL模型組大鼠、空白對(duì)照組和假手術(shù)組大鼠抽血檢測(cè)肝功能指標(biāo)，制備胸主動(dòng)脈環(huán)測(cè)定各組大鼠離體胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)不同濃度血管升壓藥物如去甲腎上腺素(NE)、去氧腎上腺素(PE)的收縮反應(yīng)性情況以及離體動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)不同濃度血管擴(kuò)張藥物如硝普鈉

4、(SNP)的舒張反應(yīng)性情況;分別用不同類(lèi)型的鉀通道阻斷劑處理血管后（阻斷血管平滑肌上相應(yīng)的鉀離子通道）觀察記錄離體血管環(huán)對(duì)NE的收縮反應(yīng)性情況，比較用藥（離子通道阻斷劑）前后，各組大鼠血管對(duì)NE的反應(yīng)性情況和收縮幅度的改變情況，據(jù)此推測(cè)各組大鼠血管平滑肌上鉀通道的功能狀況。此外，用離體實(shí)驗(yàn)比較了3、7、14天BDL大鼠血管低反應(yīng)性與內(nèi)皮之間的關(guān)系。急性酶解法分離得到大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)分別記錄正常大鼠和BDL大鼠

5、VSMCsBKCa、KATP電流，再用特異性阻斷劑北非蝎毒素(Chtx)和格列苯脲(Gllib)分別阻斷BKCa和KATP通道后得到各組大鼠VSMCs特異性的BKCa、KATP電流。分子實(shí)驗(yàn)，從各組大鼠新鮮胸主動(dòng)脈組織中提取RNA和蛋白樣本，檢測(cè)各胸主動(dòng)脈組織中BKCa、KATP通道的各亞基(BKca-α、BKca-β1、SUR-2B、Kir6.1)蛋白及mRNA的表達(dá)水平。取動(dòng)脈組織切片后，HE染色觀察動(dòng)脈組織病理學(xué)改變情況，免疫熒光

6、染色觀察胸主動(dòng)脈組織中蛋白的表達(dá)和分布情況。
　　主要結(jié)果:結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相較于正常組大鼠，BDL模型大鼠離體胸主動(dòng)脈對(duì)于不同濃度梯度血管升壓藥物(NE、PE)的反應(yīng)性顯著下降，而對(duì)于血管降壓藥物(SNP)反應(yīng)性顯著增高。分別使用不同類(lèi)型鉀通道特異性阻斷劑干預(yù)后我們發(fā)現(xiàn)，阻斷BKCa、KATP后BDL大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)對(duì)血管升壓藥物的收縮反應(yīng)較正常及假手術(shù)組大鼠胸顯著恢復(fù)，而阻斷Kv、Kir通道該現(xiàn)象不明顯，初步提示BKCa、KATP

7、通道參與導(dǎo)致BDL大鼠血管低反應(yīng)性。利用全細(xì)胞膜片鉗記錄原代分離培養(yǎng)的大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs證實(shí)在BDL模型大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上BKCa電流、KATP電流強(qiáng)度顯著增大，這一結(jié)果證實(shí)了BDL大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BKCa、KATP通道存在過(guò)度激活。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，分別提取Sham和BDL大鼠的新鮮胸主動(dòng)脈組織進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，BDL大鼠胸主動(dòng)脈BKCa通道以及KATP通道各自的輔助調(diào)節(jié)亞基BKCa-β1、SUR-2B在蛋白水平以

8、及mRNA水平均出現(xiàn)不同程度的表達(dá)上調(diào)，而其各自的孔道組成亞基BKCa-α、Kir6.1的表達(dá)變化則不明顯。胸主動(dòng)脈組織切片HE染色后發(fā)現(xiàn)，BDL大鼠與Sham大鼠對(duì)比未見(jiàn)明顯病理改變，而特異性熒光染色后也證實(shí)了血管平滑肌BKCa-β1、SUR-2B的表達(dá)上調(diào)。
　　結(jié)論:BDL模型大鼠胸主動(dòng)脈血管對(duì)血管升壓藥物的收縮反應(yīng)性顯著減弱，對(duì)舒張藥物的舒張反應(yīng)性則增強(qiáng)，表現(xiàn)為梗阻性黃疸大鼠胸主動(dòng)脈的血管低反應(yīng)性。該低反應(yīng)性早期為內(nèi)皮依賴(lài)