寧夏地區(qū)博爾納病病毒感染的細(xì)胞和分子生物學(xué)研究.pdf

1、目的：調(diào)查研究寧夏地區(qū)綿羊中的BDV的自然感染狀況。對陽性檢測樣本的核苷酸序列進(jìn)行連接測序，比較分析BDV p24基因序列，建立病毒株的種系發(fā)生樹，闡明其在寧夏地區(qū)綿羊中的自然感染情況及其可能的種系來源；應(yīng)用轉(zhuǎn)染的OL作進(jìn)一步的病毒核蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位研究，初步探討病毒的感染和發(fā)病機(jī)制。
　　 方法：應(yīng)用巢式逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR(FQ-nRT-PCR)技術(shù)檢測中國寧夏地區(qū)綿羊腦組織和PBMC中的BDV p24和p40基因片段；對檢

2、測BDV p24和p40基因片段均為陽性標(biāo)本的p24基因片段進(jìn)行連接、克隆、測序，并應(yīng)用EMBL、DNASP4.0和 MEGA4.0軟件分析核苷酸和氨基酸序列同源性相似度，構(gòu)建Neighbor-Joining基因系統(tǒng)發(fā)生樹并分析病毒感染的可能來源；對轉(zhuǎn)染的OL應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)和Western blot的方法觀察病毒核蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)定位。
　　 結(jié)果：在寧夏地區(qū)163只綿羊腦組織和710只綿羊的PBMC中檢測到BDV

3、p24和p40陽性基因片段，檢出率分別為3.68[％](6/163)和1.27[％](9/710)；對15例陽性檢出標(biāo)本進(jìn)行連接、克隆、測序，連同14例前期檢測序列基因聚合分析顯示核酸之間的同源相似度為96.5[％]～100[％]，氨基酸的同源相似度為95.3[％]～100[％]。與德國馬源性標(biāo)準(zhǔn)株He/80同源相似度較高。構(gòu)建基因的系統(tǒng)發(fā)生樹發(fā)現(xiàn)寧夏的VE患者、抑郁癥患者、綿羊和同德國馬、綿羊、奧地利馬都各自形成了獨(dú)立的支系，其余陽性

4、檢出序列形成混合支系，其中寧夏的VE患者、牛、綿羊同德國的馬、日本的綿羊形成了‘德國-中國(寧夏)-日本’的混合支系；在轉(zhuǎn)染BDV p40基因片段的熒光表達(dá)質(zhì)粒的 OL內(nèi),激光共聚焦顯微鏡提示核蛋白存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜中；Western blot的結(jié)果顯示在細(xì)胞膜蛋白中存在核蛋白，而在細(xì)胞漿中未檢測到該蛋白。
　　 結(jié)論：中國寧夏地區(qū)綿羊中可能存在BDV的自然感染；寧夏地區(qū)人和動物BDV的感染存在區(qū)域源性BDV獨(dú)立株和國外傳入基