阻斷泛素—核因子-κB信號通路防治慢性腎衰加速性動脈粥樣硬化的實驗研究.pdf

1、背景與目的： 心血管疾病是終末期腎病(end stage renal disease，ESRD)患者最常見的并發(fā)癥和最主要的死亡原因。其中尿毒癥動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)倍受關(guān)注。慢性腎衰竭患者發(fā)生AS與普通人群不同，具有發(fā)病率高、發(fā)病年齡早、病變累及廣泛等自身特點，其發(fā)病機制尚不十分清楚。傳統(tǒng)的危險因素如：高血壓、糖尿病、血脂代謝紊亂等雖在CRF病人中也較為普遍，但并不能滿意解釋慢性腎衰竭(chron

2、ic renal failure，CRF)病人心血管疾病如此高的發(fā)病率和死亡率，提示慢性腎衰竭患者體內(nèi)可能有其它因素加速了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。已明確AS實質(zhì)是血管壁細胞的慢性損傷性炎癥反應(yīng)，但目前仍缺乏有效的防治手段。ESRD患者具有嚴重的內(nèi)環(huán)境紊亂，體內(nèi)存在“微炎癥狀態(tài)”，這種微炎癥狀態(tài)可能和其動脈血管細胞慢性損傷性炎癥反應(yīng)有關(guān)，加速了動脈粥樣硬化的進展。 核因子-κB(NF-κB)是一種具有多向調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，存在于

3、多種不同的細胞類型中，處于炎癥反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的中心位置，研究其生物學(xué)特性并通過藥理學(xué)作用適當(dāng)?shù)剡M行調(diào)控，對于防治組織細胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。近來的研究發(fā)現(xiàn)，泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)是一種廣泛存在于真核細胞胞漿中非常重要的、依賴ATP的非溶酶體蛋白降解通路，可從多個環(huán)節(jié)參與調(diào)控NF-κB信號通路。且UPP組分具有明確的組織特異性，為靶向性地針對血管細胞NF-κB活化

4、提供了可能。 本課題通過建立慢性腎衰兔模型和體外細胞培養(yǎng)兩層次觀察UPP-NF-κB信號組份在慢性腎衰加速性動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中的表達和活化規(guī)律，分析阻斷泛素-蛋白酶體信號途徑對慢性腎衰主動脈血管細胞炎癥病理變化的影響，為臨床有效防治慢性腎衰加速性動脈粥樣硬化提供理論依據(jù)。 方法： 1.采用結(jié)扎左腎動脈分支并切除右腎的方法建立慢性腎衰竭兔模型，將動物隨機分為假手術(shù)組(Sham)、慢性腎衰組(CRF)、假手術(shù)

5、+MG132組(Sham+MG132)、慢性腎衰+MG132組(CRF+MG132)、假手術(shù)組+PDTC組(Sham+PDTC)、慢性腎衰+PDTC組(CRF+PDTC)。各組設(shè)術(shù)后4w、8w、12w三時相點，動態(tài)觀察血壓、腎功能、血脂、腎臟及主動脈病理變化情況。 2.采用慢性腎衰模型12 w兔血清刺激體外培養(yǎng)的兔主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，MTT、流式細胞儀及Hoechst33342染色檢測內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的形態(tài)增殖、凋亡

6、的變化。并采用MG132和PDTC進行干預(yù)，觀察其對細胞增殖的量效和時效情況。 3.免疫組化檢測主動脈中增殖細胞核抗原(PCNA)的表達變化。 4.應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組兔主動脈及體外培養(yǎng)細胞泛素(Ub)、泛素激活酶(E1)、NF-κBp65及IκBα mRNA表達變化。 5.Western blot檢測主動脈及體外培養(yǎng)細胞泛素化蛋白、E1、NF-κB、IκBα、PCNA及TNFα蛋白表達變化。 6

7、.免疫熒光檢測培養(yǎng)細胞NF-κBp65核轉(zhuǎn)位情況。 7.EMSA檢測NF-κB-DNA結(jié)合活性。 8.特異性熒光底物反應(yīng)檢測蛋白酶體活性20s亞基活性。 9.ELISA方法檢測各組兔血清和細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子IL-6、TNFα濃度。 結(jié)果： 1.結(jié)扎新西蘭白兔左腎動脈分支并切除右腎的方法建立了慢性腎衰竭動脈粥樣硬化的模型：模型組兔術(shù)后出現(xiàn)明顯的蛋白尿和血尿，并逐漸出現(xiàn)貧血；出現(xiàn)明顯的高血壓；血清

8、BUN、SCr逐漸升高；腎臟病理出現(xiàn)明顯的腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。兔主動脈逐漸出現(xiàn)脂紋、粥樣斑塊等動脈粥樣硬化早中期的變化。使用MG132和PDTC干預(yù)后能明顯減輕主動脈動脈粥樣硬化的病理變化。 2.慢性腎衰竭兔主動脈NF-κB信號通路組分表達及MG132和PDTC干預(yù)的效果：與Sham相比，NF-κBmRNA和蛋白水平表達均增加，NF-κB-DNA結(jié)合活性明顯增強，隨病程延長更為明顯。其抑制因子IκBα mRNA和蛋白水平表

9、達和NF-κB呈現(xiàn)相反的變化。MG132干預(yù)后能使NF-κBmRNA和蛋白水平表達降低；NF-κB-DNA結(jié)合活性明顯下降；IκBα mRNA和蛋白水平表達上調(diào)。PDTC干預(yù)后和MG132作用類似，證實慢性腎衰竭兔主動脈內(nèi)存在NF-κB信號通路的活化。 3.慢性腎衰竭兔主動脈泛素-蛋白酶體信號通路組分表達及MG132和PDTC的干預(yù)作用：與Sham組相比，慢性腎衰竭兔主動脈中Ub mRNA表達逐漸上調(diào)、泛素化蛋白表達未見明顯變化

10、：E1 mRNA和蛋白表達逐漸增加；蛋白酶體活性明顯增強，且隨病程進展更為明顯。MG132干預(yù)后，Ub mRNA表達下調(diào)，泛素化蛋白表達增加，E1 mRNA和蛋白表達下降；蛋白酶體活性下降。證實慢性腎衰竭兔主動脈內(nèi)存在泛素蛋白酶體通路的活化。與MG132相比，PDTC干預(yù)后對Ub mRNA和ElmRNA和蛋白表達與MG132相仿，但對蛋白酶體活性影響較小，對泛素化蛋白表達無影響。 4.慢性腎衰兔血清中的炎癥因子TNFα、IL-6

11、濃度和兔主動脈中TNFα的表達變化及MG132和PDTC的干預(yù)作用：與對照組相比，血清中的炎癥因子TNFα、IL-6濃度逐漸升高，主動脈中TNFα的表達逐漸增加。MG132和PDTC干預(yù)后均能降低血清中的炎癥因子TNFα、IL-6濃度和主動脈中TNFα的表達。證實慢性腎衰竭兔存在全身和主動脈局部的微炎癥反應(yīng)。 5.慢性腎衰血清在較低濃度時(3％～10％)時呈濃度和時間依賴性促進內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的增殖，較高濃度時(>10％)，

12、促增殖作用減弱，促細胞凋亡增強。MG132和PDTC均能抑制10％慢性腎衰血清誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖。 6.與正常血清相比，10％慢性腎衰血清能使內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞NF-κB mRNA和蛋白表達增加，IκBα mRNA和蛋白表達降低；10％慢性腎衰血清能使NF-κBp65發(fā)生核轉(zhuǎn)位；不同濃度慢性腎衰血清(3％～10％)使內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞NF-κB DNA結(jié)合活性呈濃度依賴性增加，10％慢性腎衰血清使內(nèi)皮細胞和平滑肌

13、細胞NF-κB DNA結(jié)合活性24h持續(xù)增加。MG132和PDTC干預(yù)后，能抑制10％慢性腎衰血清刺激的內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞NF-κBmRNA和蛋白的表達，增加IκBα mRNA和蛋白表達，抑制NF-κB DNA結(jié)合活性。 7.10％1熳性腎衰血清使主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞培養(yǎng)上清IL-6和TNFα含量明顯增加，刺激6小時后升高幅度最為明顯，以后仍緩慢上升。同時內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞內(nèi)TNFα蛋白表達也較對照明顯增加。MG132

14、和PDTC干預(yù)后，均能降低細胞炎癥因子TNFα、IL-6的分泌和主動脈中TNFα的表達。 8.10％慢性腎衰血清刺激后，主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞Ub和ElmRNA的表達上調(diào)，E1蛋白的表達增加，蛋白酶體活性較對照組明顯升高。MG132干預(yù)后，能抑制主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞Ub和ElmRNA的表達，降低El蛋白的表達，抑制蛋白酶體活性。與MG132相比，PDTC干預(yù)后對細胞Ub mRNA和ElmRNA和蛋白表達與MG132相仿

15、，但對蛋白酶體活性影響較小。 結(jié)論： 1、慢性腎衰竭兔隨病程的進展主動脈逐漸出現(xiàn)動脈粥樣硬化的病理改變。 2、慢性腎衰兔主動脈內(nèi)存在NF-κB信號通路的活化和炎癥細胞因子的表達，并隨慢性腎衰病程進展呈現(xiàn)出加重的趨勢。 3、慢性腎衰兔主動脈內(nèi)存在泛素-蛋白酶體信號通路的活化，阻斷泛素一蛋白酶體途徑可顯著抑制慢性。腎衰兔主動脈NF-κB信號通路的活化和炎癥細胞因子的表達；明顯減輕兔主動脈粥樣硬化的病理改變。

16、 4、較低濃度的慢性腎衰兔血清(≤10％)能促進兔主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞異常增殖，呈一定濃度和時間依賴性；而高濃度的慢性腎衰兔血清對兔主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞增殖作用減弱，促凋亡作用增強。 5、較低濃度的慢性腎衰兔血清(≤10％)能使兔主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞NF-κB信號通路的活化和炎癥細胞因子的表達，呈一定的濃度和時間依賴性。 6、較低濃度的慢性腎衰兔血清(≤10％)能使兔主動脈內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞泛素