Wnt3a-LRP5信號傳導通路對ST2細胞增殖和分化的影響.pdf

1、骨骼的生長、發(fā)育和代謝是成骨細胞和破骨細胞共同作用的結(jié)果。如果成骨細胞骨形成作用和破骨細胞骨吸收作用之間的動態(tài)平衡被破壞，就會發(fā)生骨密度和骨結(jié)構(gòu)異常，表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松癥等疾病。研究表明，骨密度與骨代謝調(diào)節(jié)明顯受遺傳因素影響。編碼低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein5,LRP5)的基因-LRP5近年來研究最多的控制骨密度的基因之一。 LRP5的功能喪失

2、性突變導致骨質(zhì)疏松癥，而功能獲得性突變導致高骨密度癥(highbonemass，HBM)。LRP5是一種單次跨膜的細胞膜表面蛋白，它作為Wnt蛋白的共受體參與經(jīng)典的Wnt信號傳導通路，由此可見經(jīng)典的Wnt/LRP5信號傳導通路在骨形成過程中具有重要作用。LRP5在骨膜內(nèi)及骨小梁表面的成骨細胞表面表達，而不在破骨細胞中表達。已有的研究結(jié)果提示LRP5基因影響骨密度是通過影響成骨細胞的功能而發(fā)生的。具有骨形成作用的成骨細胞是由間充質(zhì)干細胞(

3、mesenchymalstemcells，MSCs)分化而來的。因此，我們推測經(jīng)典的Wnt/LRP5信號傳導通路可能從增殖和/或分化兩方面影響間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的轉(zhuǎn)變，從而影響骨質(zhì)的形成。 為了分析經(jīng)典的Wnt/LRP5信號傳導通路在間質(zhì)成骨中的具體作用機制，本研究選擇Wnt3a作為經(jīng)典Wnt蛋白家族的代表和ST2細胞株作為間充質(zhì)干細胞來完成體外實驗。外源性Wnt3a的獲得是通過收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染W(wǎng)nt3acDNA的L-cell細

4、胞株的培養(yǎng)基作為條件培養(yǎng)基(conditionedmedia，CM)而實現(xiàn)的。ST2細胞株是從BC8小鼠骨髓中分離出來的一種間質(zhì)細胞株，它具有骨髓間充質(zhì)干細胞的特點，擁有多種分化潛能，在特定的體內(nèi)外微環(huán)境條件下，它可以分化為成骨細胞。堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性升高是間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化的一個重要標志。 本研究采用瞬時轉(zhuǎn)染的方式，將野生型、兩種功能喪失突變型和功能獲得突變型LRP5表達載

5、體轉(zhuǎn)染于ST2細胞，使其在ST2細胞中得以表達并發(fā)揮生物作用。利用RT-PCR、WesternBlotting和細胞免疫熒光的方法檢測ST2細胞中LRP5及不同LRP5表達載體的表達情況；將外源性Wnt3a和野生型或不同突變型LRP5同時作用于ST2細胞，利用BrdU摻入法檢測Wnt3a/LRP5信號傳導通路對細胞增殖的影響；在L-抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉誘導ST2細胞向成骨細胞分化及無定向誘導分化條件下，分別檢測Wnt3a/LRP5信

6、號傳導通路和外源性Wnt3a對細胞ALP活性的影響；分析Wnt3a/LRP5信號傳導通路是在細胞增殖還是分化或增殖和分化方面對ST2細胞產(chǎn)生影響。實驗結(jié)果表明，Wnt3a/LRP5信號傳導通路在ST2細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)變的過程中，對細胞增殖有明顯的促進作用。Wnt3a對ST2細胞的分化有促進作用。在定向誘導ST2細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)變的過程中，Wnt3a促進細胞分化的作用更顯著。 分析Wnt3a/LRP5信號傳導通路在間充質(zhì)干細胞向成