NLRX1抑制LUBAC介導(dǎo)的NF-κB激活的機(jī)制研究.pdf

1、蛋白翻譯后的泛素化修飾在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞生物功能的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。近幾年新發(fā)現(xiàn)的線性泛素鏈組裝復(fù)合體(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)由HOIP、HOIL-1L和SHARPIN組成，能夠產(chǎn)生一種新型的Met1連接的線性多聚泛素鏈，可以特異性調(diào)控經(jīng)典的NF-κB信號(hào)通路，是天然免疫反應(yīng)的重要組成部分。
　　NLRs是一類重要的胞漿型模式識(shí)別受體(PRR)，負(fù)責(zé)識(shí)別細(xì)胞內(nèi)

2、信號(hào)，是固有免疫針對(duì)病原微生物的一類重要感受器。NLRX1是NLRs家族中唯一定位于線粒體的成員，結(jié)構(gòu)較為保守，能夠通過(guò)多種途徑參與NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控，而NLRX1對(duì)LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用尚未有人報(bào)道。因此，本論文以NLRX1為研究對(duì)象，初步探討了其對(duì)LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的影響，并進(jìn)一步解釋其作用機(jī)制。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.NLRX1抑制LUBAC誘導(dǎo)的NF-κB啟動(dòng)子活化
　

3、　在HEK-293T細(xì)胞中，分別轉(zhuǎn)染LUBAC、NF-κB-Luc、pRL-TK和不同劑量的NLRX1真核表達(dá)質(zhì)粒，雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠顯著抑制LUBAC激活的NF-κB啟動(dòng)子活性，并且呈劑量依賴性。說(shuō)明NLRX1能夠負(fù)調(diào)控LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路。
　　2.從互作角度探究NLRX1和LUBAC的關(guān)系
　　LUBAC由HOIL-1L、HOIP和SHARPIN組成，為了探究NLRX1負(fù)調(diào)控LUBA

4、C介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的作用機(jī)制，我們首先從互作角度探究NLRX1和LUBAC的關(guān)系。通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)(CO-IP)發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)條件下NLRX1與HOIL-1L、HOIP和SHARPIN均存在相互作用，但生理?xiàng)l件下，NLRX1只與HOIP存在互作，且NLRX1是通過(guò)其NOD結(jié)構(gòu)域與HOIP的UBA結(jié)構(gòu)域互作;同時(shí)還發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠抑制LUBAC復(fù)合物的形成，減少LUBAC對(duì)NEMO的招募。
　　3.NLRX1發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用

5、的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域?yàn)長(zhǎng)RR結(jié)構(gòu)域
　　為了探究NLRX1發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建了NLRX1的4個(gè)截短突變體，NLRX1-N-ter(1-468bp)、NLRX1-ΔN-ter(469-2928bp)、NLRX1-LRR(976-2928bp)和NLRX1-ΔLRR(1-975bp)。用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRX1的LRR結(jié)構(gòu)域在負(fù)調(diào)控LUBAC依賴的NF-κB通路中發(fā)揮著重要作用。
　　4.NLRX1對(duì)LU

6、BAC定位及表達(dá)的影響
　　利用間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)檢測(cè)NLRX1對(duì)LUBAC定位的影響，發(fā)現(xiàn)NLRX1和LUBAC存在共定位且定位于胞漿，NLRX1對(duì)LUBAC的定位幾乎沒(méi)有影響。熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)表明NLRX1也不影響LUBAC的mRNA水平;Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NLRX1特異性抑制HOIP的表達(dá)，且呈劑量依賴性，但用MG132處理后，與對(duì)照組相比，HOIP的表達(dá)得到恢復(fù)，表明NLRX1介導(dǎo)的HOIP的降解是

7、通過(guò)蛋白酶體途徑實(shí)現(xiàn)的。
　　5.NLRX1抑制NEMO的線性泛素化修飾
　　在LUBAC介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路中，LUBAC能夠招募NEMO并對(duì)其進(jìn)行線性泛素化修飾，引起IKK復(fù)合物的活化及IκBα的降解，促使NF-κB的釋放和入核。為了驗(yàn)證NLRX1降解HOIP的生物學(xué)意義，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NLRX1對(duì)內(nèi)源性NEMO的線性泛素化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRX1能夠抑制內(nèi)源性NEMO的線性泛素化修飾，進(jìn)而負(fù)調(diào)控LUBAC