NF-κB介導LPS對家蠶表皮蛋白基因BmCPT1的激活.pdf

1、昆蟲表皮是隔離其自身內(nèi)環(huán)境和外界復雜環(huán)境的一道重要屏障，也是其防御病原微生物的一道物理屏障，其主要成分是表皮蛋白和幾丁質(zhì)，因此表皮蛋白是一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白。昆蟲的先天性免疫反應通過其模式識別受體特異性識別病原菌表面的某些靶標分子，區(qū)分出“自我”與“非我”成分，從而引發(fā)細胞免疫和體液免疫中的Toll信號途徑和IMD信號通路及酚氧化酶原級聯(lián)反應，產(chǎn)生相應的抗菌肽快速高效清除侵入的病原菌。NF-κB途徑是Toll和IMD信號通路下游的調(diào)控路徑

2、。受逐級呈遞的免疫信號活化，NF-κB家族的相關轉(zhuǎn)錄因子從抑制子上解離轉(zhuǎn)運入核，結(jié)合到相關抗菌肽基因的啟動子或增強子上，從而調(diào)控抗菌肽基因的表達。雖然家蠶（Bombyxmori）基因組框架序列在2004年已被測定，極大地推動了家蠶先天性免疫方面的研究，但是家蠶表皮蛋白受到免疫信號激活方面的研究仍然很少。
　　 本文通過在家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中檢索得到家蠶表皮蛋白基因BmCPT1的序列，對其上游2002bp的啟動子區(qū)域進行分子克隆，并

3、利用TESS程序分析了該區(qū)域所含有的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，發(fā)現(xiàn)BmCPT1基因的啟動子內(nèi)含有一個NF-κB結(jié)合位點。將該段序列連接到pGL3-basic載體上，將所獲得pGL3-basic{pBmorCPT1-Luciferase}報告載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到家蠶卵巢細胞BmN中，通過添加LPS和NF-κB信號阻斷劑PDTC檢測NF-κB能否激活BmCPT1基因的表達，并將檢測到的熒光素酶表達活性數(shù)據(jù)進行顯著性分析。結(jié)果證明BmCPT1基因的啟動子能

4、被LPS激活，而這種激活效應能被NF-κB信號阻斷劑所抑制。為進一步驗證熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果的可靠性，我們將滅活后的大腸桿菌注射到5齡3天家蠶大造(p50)品系中，12h后提取誘導處理家蠶的脂肪體組織，從中得到脂肪體組織的核蛋白，根據(jù)BmCPT1基因中含有的NF-κB序列設計標記探針與突變探針，進行凝膠阻滯實驗，證實家蠶的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子BmRelish1能夠結(jié)合到BmCPT1基因上游啟動子的NF-κB結(jié)合位點上，說明LPS對BmCP