誘生型熱休克蛋白70與TRAF6結(jié)合抑制LPS激活的NF-κB信號通路.pdf

1、炎癥反應(yīng)是機體清除入侵病原體而引發(fā)的一個生理和病理性反應(yīng)。機體在病原刺激后，通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)將病原體清除，是一種生理性的防御反應(yīng)；在此過程中，如炎癥反應(yīng)過度，大量炎性因子分泌，將造成組織的炎性損傷，導(dǎo)致多種急、慢性炎癥反應(yīng)性疾病的發(fā)生(如：膿毒癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病等，嚴(yán)重的甚至危及生命)，此時的炎癥反應(yīng)又是一種病理性的損傷反應(yīng)。因此，研究炎癥反應(yīng)的調(diào)控過程具有重要的意義。 炎癥反應(yīng)主要通過炎性細(xì)胞和炎性因子來完成，炎性因子的

2、分泌由促炎癥因子調(diào)控，促炎癥因子的轉(zhuǎn)錄合成又受嚴(yán)格的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控，其中NF-kappaB(NF-kB)通路是其主要調(diào)節(jié)通路。促炎癥因子主要包括一些細(xì)胞因子和其他的酶類。TNF和IL-1是最關(guān)鍵的炎性細(xì)胞因子，關(guān)鍵酶類有誘生型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶-2(COX-2)等。現(xiàn)己證實，他們的異常產(chǎn)生與炎癥反應(yīng)性疾病有關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，NF-KB是調(diào)節(jié)促炎癥因子產(chǎn)生的重要轉(zhuǎn)錄因子，某些疾病NF-kB的活性高于正常人。抑制NF-kB

3、可以抑制iNOS和COX-2的合成。LPs激活NF-kB信號通路須要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)的存在，在LPS活化其受體TLR4之后，TRAF6自身泛素化，激活下游的IKK及NF-kB，啟動基因的轉(zhuǎn)錄。 誘生型熱休克蛋白70(Hsp70)是細(xì)胞在應(yīng)激條件下產(chǎn)生的最重要的一種熱休克蛋白，對于維持正常生理狀態(tài)下和病理狀態(tài)下的細(xì)胞完整性具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70具有抑制NF-kB的激活并能抑制iNOS

4、和COX-2的產(chǎn)生的作用，機理并不十分清楚。為此，我們研究探討了Hsp70與TRAF6的相互作用以及對NF-kB通路的影響。我們研究發(fā)現(xiàn)： 1．Hsp70與TRAF6結(jié)合，結(jié)合區(qū)域位于TRAF6的C端TRAF-C結(jié)構(gòu)域。將 Flag-TRAF6質(zhì)粒和Xpress-Hsp70以磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)入HEK293細(xì)胞，免疫沉淀和免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)TRAF6與Hsp70能產(chǎn)生共沉淀。Hsp70與TRAF6的結(jié)合區(qū)域為Hsp70含有多肽底物

5、結(jié)合結(jié)構(gòu)域的C端。在小鼠來源巨噬樣細(xì)胞RAW264．7細(xì)胞株中，發(fā)現(xiàn)熱休克誘導(dǎo)產(chǎn)生的Hsp70與內(nèi)源性TRAF6結(jié)合，并且在一定的時間范圍內(nèi)隨著LPS的刺激Hsp70與TRAF6結(jié)合明顯減少，提示Hsp70可能通過結(jié)合TRAF6對NF-KB的激活發(fā)揮影響。 2．Hsp70通過與TRAF6結(jié)合抑制NF-KB信號通路。為了研究Hsp70對NF-KB 信號通路的調(diào)節(jié)作用，建立了穩(wěn)定表達Hsp70的RAW264．7細(xì)胞株。與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p

6、cDNA3質(zhì)粒的對照細(xì)胞相比，穩(wěn)定表達Hsp70的RAW264.7細(xì)胞中 LPS激活的IKK磷酸化和IkB的降解被抑制。熱刺激后RAW264．7細(xì)胞經(jīng) LPS刺激，觀察到類似的抑制效應(yīng)。但由于熱休克在誘導(dǎo)了Hsp70表達的同時，也使IKKB的蛋白量減少，因此，熱休克對于NF-kB信號通路的抑制效應(yīng)可能不僅僅是由于其與TRAF6的相互作用。應(yīng)用NF-kB熒光素酶報告基因研究發(fā)現(xiàn)，Hsp70抑制TRAF6過表達激活的NF-kB和LPS激活的

7、NF-kB。在產(chǎn)物水平，應(yīng)用免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)Hsp70抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS和 COX-2的表達。 3．Hsp70抑制TRAF6的泛素(Ub)化修飾。TRAF6被泛素分子以第63位賴氨酸(K63)的形式修飾，該種修飾是TRAF6的活化形式。在HEK293細(xì)胞，通過共轉(zhuǎn)染Flag-TRAF6質(zhì)粒、HA-Ub質(zhì)粒以及Flag-TRAF6質(zhì)粒、HA-Ub質(zhì)粒和Xpress-Hsp70質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)TRAF6被明顯泛素化修飾，

8、Hsp70的表達明顯抑制了TRAF6的泛素化，表明Hsp70可能通過抑制TRAF6泛素化抑制NF-kB信號通路。 4．Hsp70抑制NF-kB和TRAF6泛素化的作用需要全長Hsp70蛋白分子。作為分子伴侶，Hsp70具有N-端的ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C-端的多肽底物結(jié)構(gòu)域及一個可變的C-端的結(jié)構(gòu)域。我們的研究表明，含有ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域的Hsp70缺失突變體和含多肽底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域C端的Hsp70缺失突變體均不能抑制 NF-KB的激活