豬源腸外致病性大腸桿菌T6SS效應(yīng)分子Rhs的功能及作用機(jī)制研究.pdf

1、細(xì)菌能運(yùn)用多種機(jī)制有效地將蛋白運(yùn)輸?shù)桨猓浞置诘牡鞍自诩?xì)菌和宿主相互作用、細(xì)菌間的競(jìng)爭(zhēng)以及細(xì)菌與環(huán)境對(duì)抗的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前，在革蘭氏陰性菌中被報(bào)道存在6種主要的分泌系統(tǒng)(TypeⅠ-Ⅵ secretion system)。2006年TypeⅥ secretion system(T6SS)首次被報(bào)道于霍亂弧菌和銅綠假單胞菌中，與其致病性相關(guān)。T6SS作為一種蛋白分泌裝置將效應(yīng)蛋白直接注射到靶細(xì)中，其分泌的效應(yīng)蛋白既能靶向原核

2、生物也可以作用于真核生物。效應(yīng)蛋白被T6SS識(shí)別和分泌主要有兩種模式:與T6SS結(jié)構(gòu)蛋白融合表達(dá)分泌出去;另一種方式則是與T6SS核心組件形成非共價(jià)鍵被攜帶出去。這兩種分泌模式都與T6SS的Hcp-VgrG-PAAR管道結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。
　　Rhs(Rearrangement hotspot)作為細(xì)菌T6SS的效應(yīng)蛋白，被報(bào)道在細(xì)菌的接觸依賴性生長(zhǎng)抑制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Rhs是一類分子量比較大的T6SS效應(yīng)蛋白，由保守的N端、核心

3、區(qū)以及多變的C端構(gòu)成。Rhs基因的C端(RhsCT)是其毒性發(fā)揮的關(guān)鍵部位。Rhs的C端通常編碼酶類蛋白或者穿孔素活性蛋白，以此作用于靶細(xì)胞的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜以及細(xì)胞核，如:脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、脫氨酶、金屬肽酶。在Rhs基因下游通常存在其免疫蛋白基因RhsI(Rhs Immunity Protein)，RhsI對(duì)Rhs所產(chǎn)生的毒性具有中和作用，以此避免細(xì)菌受到自身分泌的效應(yīng)蛋白的破壞。
　　在本研究的豬源腸外致病性大腸桿菌P

4、CN033中，通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們找到了四個(gè)經(jīng)典的Rhs蛋白，并分別命名為Rhs1、Rhs2、Rhs3、Rhs4。其中Rhs2在T6SS基因簇內(nèi)，位于T6SS基因vgrG2的下游;Rhs1、Rhs3、Rhs4在T6SS基因簇外部，Rhs1位于vgrG4基因下游。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)Rhs1、Rhs2、Rhs3、Rhs4的N端都存在PAAR的結(jié)構(gòu)。通過(guò)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)Rhs1的C端與穿孔素蛋白4oeb A具有一定的相似性，而Rhs2

5、、Rhs3、Rhs4并未比對(duì)出結(jié)果。為此，我們展開(kāi)了以下實(shí)驗(yàn):
　　1基因缺失株⊿Rhs1 CT、⊿Rhs2CT、⊿Rhs3CT、⊿Rhs4CT的構(gòu)建
　　以親本菌株P(guān)CN033為模版擴(kuò)增Rhs1CT、Rhs2CT、Rhs3CT、Rhs4CT基因上下游同源臂，將上下游同源臂串聯(lián)連接在pRE112載體上，由此構(gòu)建成重組載體pRE112-⊿Rhs1CT、pRE112-⊿Rhs2CT、 pRE112-⊿Rhs3CT、 pRE112

6、-⊿Rhs4CT。將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌X7213感受態(tài)細(xì)胞中，以X7213為供體菌，親本菌株為受體菌，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方法將重組質(zhì)粒整合至親本菌基因組中，由此獲得單交換菌株。通過(guò)無(wú)鹽LB培養(yǎng)基和蔗糖LB交替?zhèn)鞔鷨谓粨Q菌株，篩選出對(duì)Cm敏感和蔗糖耐受菌株即為雙交換菌株。用RhsCT基因的引物和外源引物鑒定雙交換菌株。我們成功構(gòu)建了⊿Rhs1CT、⊿Rhs2CT、⊿Rhs3CT、⊿Rhs4CT四個(gè)單基因缺失株。
　　2 RhsCT蛋

7、白的原核表達(dá)及毒性研究
　　以PCN033基因組為模板擴(kuò)增Rhs1CT、 Rhs2CT、 Rhs3CT、Rhs4CT基因全長(zhǎng)，分別連接到pET-28a載體上，再轉(zhuǎn)化至BL21菌株中。然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)條件的摸索，經(jīng)過(guò)多個(gè)條件的摸索后，只有Rhs4CT表達(dá)在包涵體中，而Rhs1 CT、Rhs2CT和Rhs3CT都未表達(dá)。為此，我們將以上做表達(dá)的BL21菌株以及含空載體的BL21菌株重新復(fù)蘇，OD600調(diào)成一致，經(jīng)過(guò)倍比稀釋后，分別蘸等

8、量各個(gè)稀釋度的菌液于K50平板和K50+IPTG平板上誘導(dǎo)過(guò)夜，我們發(fā)現(xiàn)相比于含空載體的BL21菌株，含Rhs1CT、Rhs2CT和Rhs3CT基因的BL21菌株在有誘導(dǎo)劑的平板上生長(zhǎng)明顯受到抑制，而含Rhs4CT基因的BL21菌株在有誘導(dǎo)劑的平板上生長(zhǎng)不受影響。因此，我們認(rèn)為Rhs1CT、Rhs2CT、Rhs3CT這三個(gè)蛋白對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的毒性作用。
　　3免疫蛋白R(shí)hsI的驗(yàn)證
　　細(xì)菌為了避免被自身分泌的效應(yīng)蛋白傷

9、害，通常細(xì)菌會(huì)同時(shí)表達(dá)能中和效應(yīng)蛋白毒性的免疫蛋白。通過(guò)ORF finder，我們預(yù)測(cè)出Rhs1CT、Rhs2CT和Rhs3CT的免疫蛋白R(shí)hs1I、Rhs2I、Rhs3I。然后將去掉終止密碼子的RhsCT基因與RhsI基因融合連接到pET-28a將載體上。通過(guò)平板誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，我們成功驗(yàn)證出效應(yīng)蛋白R(shí)hs2CT和Rhs3CT對(duì)應(yīng)的免疫蛋白R(shí)hs2I、Rhs3I。遺憾的是，由于效應(yīng)蛋白與免疫蛋白相互作用的機(jī)制并不清楚，我們并未驗(yàn)證出對(duì)Rhs

10、1CT有中和作用的Rhs1I。
　　4 RhsCT基因缺失株及野生株致病性研究
　　我們想從活體水平和細(xì)胞水平上論證RhsCT細(xì)菌致病中的作用。首先我們將缺失株與親本株以同等劑量107的菌量靜脈注射至小鼠體內(nèi)，對(duì)血液、腦、肺、脾的載菌量計(jì)數(shù)比較后，我們發(fā)現(xiàn)相比于野生株，Rhs1CT基因缺失后，細(xì)菌在動(dòng)物的血液、肺臟和腦部的定殖能力明顯下降，而其他三個(gè)基因缺失株并沒(méi)有明顯差異?；谶@一結(jié)果，我們又將野生株與⊿Rhs1CT以2×