六型分泌系統(tǒng)在豬源腸外致病性大腸桿菌引起宿主天然免疫過程中的作用研究.pdf

1、革蘭氏陰性菌已經(jīng)進(jìn)化出多種蛋白質(zhì)分泌系統(tǒng)，以輸出或輸入跨膜大分子來適應(yīng)環(huán)境和存活。2006年，Ⅵ型分泌系統(tǒng)(TypeⅥSecretion System，T6SS)首次在銅綠假單胞菌和霍亂弧菌中作為新型的細(xì)菌蛋白分泌系統(tǒng)被定義，并證明其與致病性有關(guān)且介導(dǎo)致病菌與宿主的相互作用。T6SS廣泛存在于約四分之一的革蘭氏陰性菌中，是一種多功能的注射裝置，可以將效應(yīng)分子傳遞至環(huán)境、真核宿主和原核競爭者。T6SS由跨膜復(fù)合物和類似噬菌體尾鞘的針管狀結(jié)

2、構(gòu)組成。關(guān)于T6SS的結(jié)構(gòu)研究中，普遍認(rèn)為Hcp是T6SS的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)組分，以頭對頭或頭對尾的方式聚合形成環(huán)狀六聚體從而形成T6SS的內(nèi)管道，在鞘收縮時推動T6SS靶向細(xì)胞以輸送效應(yīng)蛋白。作為T6SS結(jié)構(gòu)重要組成部分的同時，Hcp的分泌作為T6SS發(fā)揮功能的標(biāo)志。
　　有關(guān)細(xì)菌分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機(jī)制研究已取得重大進(jìn)展。近年來，關(guān)于分泌系統(tǒng)在宿主一致病菌的互作中尤其是關(guān)于免疫應(yīng)答的復(fù)雜作用己成為研究熱點(diǎn)。細(xì)菌分泌系統(tǒng)傳送效應(yīng)分子來干擾宿

3、主細(xì)胞的正常生理功能，以一定的方式影響炎性小體通路。本研究中，PCN033是分離于病豬的腸外致病性大腸桿菌，通過全基因組測序發(fā)現(xiàn)其含一套T6SS基因簇。如其他致病性大腸桿菌一樣，PCN033的基因組中有3個hcp拷貝，其中兩個位于T6SS基因簇內(nèi)，另一個位于T6SS基因簇外，分別命名為hcp1、hcp2、hcp3。本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建了并保存了Δhcp1Δhcp2Δhcp3缺失株，hcp作為T6SS發(fā)揮功能的標(biāo)志，缺失hcp后，T6SS無法正

4、常組裝進(jìn)而發(fā)揮作用，故本研究利用PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3兩個菌株，對PCN033感染后的宿主應(yīng)答及T6SS在激活炎癥過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行了探究，主要內(nèi)容如下:
　　1.RNA-seq檢測PCN033感染后RAW264.7的轉(zhuǎn)錄組變化
　　選擇小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7為PCN033的宿主細(xì)胞模型，對感染PCN033后宿主細(xì)胞RAW264.7內(nèi)發(fā)生的轉(zhuǎn)錄組變化進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了508個差異表達(dá)的基因，對差異

5、基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)在GO數(shù)據(jù)庫中，與之相關(guān)且有統(tǒng)計學(xué)意義的涉及2052項生物過程、133種細(xì)胞組分、211個分子功能及52種KEGG代謝通路。差異基因參與的KEGG代謝通路中與天然免疫相關(guān)的有NF-κB、TNF、Apoptosis、TLR、NLR等信號通路。
　　2.PCN033激活NF-κB信號通路和NLRP3、NLRC4炎性小體
　　通過Western-blot檢測PCN033感染后RAW264.7中NF-κB信號通

6、路的激活情況和胞內(nèi)蛋白NLRP3、NLRC4、ASC的表達(dá)情況。結(jié)果表明，隨著感染時間增加，p65發(fā)生磷酸化、IκBα降解，NLRP3、NLRC4及ASC的表達(dá)均明顯上調(diào)。這說明，PCN033感染后激活NF-κB信號通路和NLRP3、NLRC4炎性小體。
　　3.T6SS在PCN033與宿主互作過程中的作用
　　有文獻(xiàn)報道T6SS能夠促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。對細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)Δhcp1Δhcp2Δh

7、cp3感染相對于PCN033感染后的細(xì)胞毒性顯著降低，表明了T6SS對小鼠巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用有促進(jìn)作用。PCN033、Δhcp1Δhcp2Δhcp3以同樣的劑量靜脈注射小鼠后，通過ELISA測定小鼠血清中的IL-1β。發(fā)現(xiàn)相對于野毒株P(guān)CN033，缺失hcp后感染使得小鼠產(chǎn)生IL-1β的能力減弱，也就是說T6SS以一定的方式參與PCN033促進(jìn)IL-1β的釋放。進(jìn)一步，我們對炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)T6SS對促