AcAPc2蛋白的純化及其抗腫瘤作用機制的初步研究.pdf

1、犬鉤蟲抗凝血肽 c2(Ancylostoma caninum anticoagulantpeptide c2，AcAPc2)是從吸血寄生蟲——犬鉤蟲(Ancylostoma caninum)中分離出來的一種具有抑制組織因子-VⅡa復合物(fVⅡ a/TF)的蛋白。它通過結合于fXa的催化活性中心以外的部位而進一步特異性抑制fVⅡa/TF復合物。由于fVⅡ a/TF復合物在凝血級聯(lián)反應中起關鍵作用，因此AcAPc2可有效地抑制凝血。AcA

2、Pc2首先是由Stanssens等利用分子克隆技術分離出來的，它由84個氨基酸組成。盡管已有報道表明AcAPc2己實現(xiàn)了在E coli和酵母中表達，然而該重組蛋白與天然的AcAPc2氨基酸序列存在一定的差異，這在一定程度上會影響目的蛋白的空間結構，進而影響蛋白的功能。到目前為止，利用基因工程的方法表達與天然AcAPc2氨基酸序列相同的AcAPc2(r AcAPc2)尚無文獻報道。 蛋白質(zhì)剪接(protein splicing)是

3、在蛋白質(zhì)內(nèi)含肽(intein)的自我催化作用下從翻譯后的蛋白質(zhì)前體中切除蛋白質(zhì)內(nèi)含肽，同時兩側的蛋白質(zhì)外顯肽(extein)通過連接反應形成一個新的具有生物活性的蛋白質(zhì)。intein對于蛋白質(zhì)工程來說是一個功能強大的工具。Intein與ex-tein幾乎沒有序列同源性，天然的extein常?？梢蕴鎿Q成外源的蛋白質(zhì)而不影響intein的剪切活性。這一點是以intein作為融合蛋白進行蛋白質(zhì)純化的理論基礎。IMPACT<'TM>-TWIN系

4、統(tǒng)利用intein的自剪切實現(xiàn)了蛋白的純化。利用這一系統(tǒng)可以得到與天然蛋白序列一致的重組蛋白質(zhì)。本研究利用pTWIN1表達載體，根據(jù)AcAPc2蛋白的氨基酸序列設計引物，利用引物搭橋PCR的方法合成AcAPc2的全長cDNA序列，成功構建了AcAPc2原核表達載體pTWIN1-AcAPc2，實現(xiàn)了AcAPc2在大腸桿菌中的高效表達。利用pTWIN1載體的SSP dnaB intein的自剪切和CBD與幾丁質(zhì)的緊密結合，獲得了具有抗凝活性

5、的、與天然AcAPc2蛋白氨基酸序列一致的rAcAPc2蛋白。絲氨酸蛋白酶參與體內(nèi)各種生命活動的調(diào)控，調(diào)節(jié)生物體內(nèi)許多重要的生命過程。研究表明某些絲氨酸蛋白酶抑制劑對腫瘤細胞的增殖有抑制作用，并且可以誘導某些腫瘤細胞的凋亡。作為絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員之一，AcAPC2可能會對腫瘤細胞的增殖具有抑制作用。 本研究通過SRB染色法發(fā)現(xiàn)，rAcAPc2蛋白能劑量依賴性地抑制人肺癌細胞NCI—H460的體外增殖。在rAcAPc2濃度

6、達到100μg/ml時，NCI-H460細胞生長抑制率達到69％。隨后的DAPI染色、TUNEL和流式細胞術檢測結果表明。rAcAPc2能夠誘導NCI-H460細胞發(fā)生凋亡。有資料顯示uPA/uPAR在惡性腫瘤組織中的表達水平高于正常組織和良性腫瘤，其表達水平與患者的預后有關。因此，uPA/uPAR系統(tǒng)被認為在腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移過程中具有重要作用。2006年，Subramanian et al．報道uPA/uPAR轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)可以

7、直接誘導細胞凋亡<'[26]>。有鑒于此，我們采用RT-PCR的方法，檢測經(jīng)rAcAPc2蛋白處理的NCI-H460細胞 (rAcAPc2<'+>)的尿激酶型纖溶酶原激活劑(urokinase—type plasminogen activator，uPA)和尿激酶型纖溶酶原激活劑受體(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)的mRNA表達情況，結果顯示：隨著rAcAPc2劑量

8、的增高，NCI—H460細胞uPA和uPAR的mRNA表達水平隨之降低。已經(jīng)證實，細胞內(nèi)uPA蛋白合成增加主要是由基因轉(zhuǎn)錄水平引起的，轉(zhuǎn)錄因子NF-kB在uPA和uPAR基因表達調(diào)控中起重要作用，它可以增加uPA和uPAR的轉(zhuǎn)錄表達，從而促進腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移。NF-kB參與腫瘤細胞的增殖和抗凋亡作用過程，這是以NF-kB的活化為前提的?；罨腘F-kB可以上調(diào)一系列抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄和表達，從而抑制腫瘤細胞凋亡。NF-kB的活化依賴于26S

9、蛋白酶體的識別及其對IkBα蛋白的水解。為了進一步研究rAcAPc2蛋白誘導NCI-H460細胞凋亡的機制，我們采用Western blot方法，使用NF-kB、IkBα多克隆抗體分別對rAcAPc2處理組和非處理組的細胞核蛋白和胞質(zhì)蛋白進行檢測，結果顯示隨著rAcAPc2劑量的增高，NCI-H460細胞核中NF-kB蛋白量隨之降低而胞質(zhì)中IkBα蛋白量則隨之升高。為了進一步驗證rAcAPc2是否影響NF-kB的活化，我們采用免疫組化和

10、免疫熒光的方法檢測NF-kB在細胞中的分布情況，結果表明隨著rAcAPc2劑量的增高，NCI-H460細胞核中NF-kB蛋白水平隨之降低。隨后的EMSA法對核蛋白的測定結果顯示對照組中NF-kappa B結合活性較強，而rAcAPc2處理組中隨著rAcAPc2劑量的增加，NF-kappa B結合活性呈降低趨勢。我們還檢測了NCI-H460細胞26S蛋白酶體在不同濃度rAcAPc2作用下的胰蛋白酶活性，結果顯示25μg/ml rAcAPc

11、2即可抑制細胞26S蛋白酶體的胰蛋白酶活性，且隨著rAcAPc2劑量的增加，細胞26S蛋白酶體的胰蛋白酶活性顯著降低。我們的實驗結果表明，rAcAPC2蛋白通過抑制26S蛋白酶體活性抑制了IkBα蛋白的降解，進而抑制了NF-kB的活化。以上結果顯示通過簡單的蛋白表達純化系統(tǒng)，可以得到高表達的rAcAPc2-CBD—intein融合蛋白。利用pH-依賴型的Ssp dnaB intein的剪切，可以直接純化出純度為98％rAcAPc2。重要

12、的是，rAcAPc2具有延長血漿凝血酶原時間和活化的部分凝血活酶時間及抑制胰蛋白酶活性的功能，而且這種抗凝活性和抑制胰蛋白酶活性是呈劑量效應的。高純度、高活性的rAcAPc2的獲得，不僅為AcAPc2蛋白的功能研究提供研究對象，而且為血栓相關疾病的治療提供新的藥物。進一步的研究表明rAcAPc2蛋白可以抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡。其機制可能是rAcAPc2蛋白通過抑制26S蛋白酶體活性抑制了IkBα的降解，從而抑制NF-kB的活