臨床分離耐藥的革蘭陰性菌脂多糖脂質(zhì)體的制備及其免疫保護(hù)性作用的初步研究.pdf

1、目的： 革蘭陰性菌(Gram-negative bacterial，GNB)感染敗血癥、內(nèi)毒素血癥及休克的臨床病死率很高，是住院患者死亡的重要原因，也是抗感染治療的一大難題。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是GNB的關(guān)鍵因子，具有雙重功能：一方面，LPS是造成GNB敗血癥的真正原因；而另一方面，適量的LPS又可增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫功能，誘導(dǎo)機(jī)體的內(nèi)毒素耐受。本研究嘗試應(yīng)用GNB臨床分離的多重耐藥株的L

2、PS，制備相應(yīng)的LPS脂質(zhì)體主動(dòng)免疫小鼠，以尋求有效預(yù)防醫(yī)院內(nèi)多重耐藥菌感染的新方法。 方法： 酶法提取GNB臨床分離耐藥株的LPS，按照LPS/磷脂(wt)為1:10的比例，運(yùn)用逆向蒸發(fā)法將LPS與磷脂-膽固醇貯存液(PC:PS:Chol摩爾比例為4:1:4)制備成LPS脂質(zhì)體。以鱟變形細(xì)胞溶解物試驗(yàn)(Limulus Amebocytelysate test，LAL，以下簡稱鱟試驗(yàn))分別測(cè)定游離LPS和LPS脂質(zhì)體的內(nèi)

3、毒素活性以評(píng)價(jià)脂質(zhì)體的包封率，激光散射法分析其粒徑分布，透射電鏡觀察其形態(tài)。建立半乳糖胺(D-GalN)小鼠模型，以LPS脂質(zhì)體進(jìn)行主動(dòng)免疫后，觀察同一菌株LPS、同一菌種不同菌株LPS及不同菌種LPS攻擊小鼠的致死性試驗(yàn)結(jié)果。 結(jié)果： 根據(jù)Dijkstra等人采用的逆向蒸發(fā)法[磷脂(PC：PS：Chol)的摩爾比例為4:1:4，LPS/磷脂(wt)為1:10]制備的不同菌種LPS脂質(zhì)體常溫下呈乳白色混懸液，透射電鏡下，

4、呈規(guī)則的球形，粒徑分布均勻，直徑在300-600nm*本課題為天津市教委資助項(xiàng)目(20030207)與未經(jīng)脂質(zhì)體包被的同種LPS相比，LPS脂質(zhì)體的內(nèi)毒素活性降低了10<'2>-10<'3>倍。由此推算出經(jīng)逆向蒸發(fā)法所制備的LPS脂質(zhì)體的包封率在99-99.9％。 在為期90天的穩(wěn)定性試驗(yàn)中，所有樣品無論在常規(guī)條件(4℃)下還是在加速條件(37℃)下，在任何時(shí)間點(diǎn)均未發(fā)生LAL活性的改變。于30天取樣進(jìn)行電鏡觀察，脂質(zhì)體形態(tài)無明

5、顯變化，粒徑分析僅顯示有粒徑的輕度增加。 LPS脂質(zhì)體在劑量相當(dāng)大時(shí)無明顯的致熱原性，且不引起動(dòng)物的中毒反應(yīng)(如體重下降、昏睡或交替呼吸等)。 Pa5脂多糖脂質(zhì)體(Pa5-L-LPS，以下同)免疫后，小鼠無論是接受銅綠假單胞茵屬的L2S還是全菌攻擊，試驗(yàn)組的生存率和生存時(shí)間均高于對(duì)照組(p<0.05)；同菌種之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與其他菌屬細(xì)菌攻擊的試驗(yàn)組相比，無論是LPS還是全菌攻擊，銅綠假單胞菌屬攻擊的試驗(yàn)組生存率和生

6、存時(shí)間均顯著高于大腸桿菌屬攻擊的試驗(yàn)組(p<0.05)，但其生存率與克雷伯菌屬攻擊的試驗(yàn)組間并無顯著性差異，僅可相對(duì)延長后者的生存時(shí)間(p<0.05)。 E5-L-LPS免疫后，小鼠無論是接受大腸桿菌屬LPS還是全菌攻擊，試驗(yàn)組與對(duì)照之間存在生存率和生存時(shí)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)，接受銅綠假單胞菌的LPS和克雷伯菌屬LPS攻擊時(shí)，生存率無顯著性變化，但試驗(yàn)組的生存時(shí)間明顯延長(p<0.05)。 結(jié)論： 本試