多重耐藥革蘭陰性菌基因診斷與醫(yī)院感染的臨床、分子流行病學(xué)研究.pdf

1、醫(yī)院感染中革蘭陰性菌約占60％～70％，是引起人類感染性疾病的主要病原之一。近年來全球各地細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)表明，革蘭陰性菌對(duì)臨床常用抗菌藥物耐藥性日益嚴(yán)重，耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細(xì)菌、非發(fā)酵菌比例逐年升高，且對(duì)其他臨床常用抗菌藥物也呈現(xiàn)多重耐藥，但是針對(duì)這部分“超級(jí)細(xì)菌”的抗菌藥物研發(fā)明顯落后，它所導(dǎo)致的感染治療困難，病死率高，已成為醫(yī)學(xué)界和公眾都非常關(guān)注和擔(dān)憂的問題。
　　常規(guī)病原學(xué)診斷方法包括細(xì)菌培養(yǎng)、分離及藥敏試驗(yàn)，所需

2、時(shí)間長(zhǎng)，難以及時(shí)指導(dǎo)感染性疾病的病原治療。隨著分子生物學(xué)與細(xì)菌基因組學(xué)的發(fā)展，快速、靈敏的核酸檢測(cè)方法已開始用于病原學(xué)的快速診斷及某些耐藥基因的檢測(cè)。本課題在分析臨床常見病原菌共有的23S rRNA基因及革蘭陰性菌主要耐藥基因的基礎(chǔ)上，探索建立可用于檢測(cè)多重耐藥革蘭陰性菌的快速基因診斷方法，并應(yīng)用于臨床，有望為耐藥菌早期病原診斷、耐藥性分析提供客觀依據(jù)，從而及時(shí)、正確指導(dǎo)臨床抗感染治療方案的選擇。
　　預(yù)防重于治療，醫(yī)院感染中絕大

3、部分患者系經(jīng)過直接或間接接觸感染，屬于可控、可防的環(huán)節(jié)，切斷傳播途徑有望減少醫(yī)院感染的發(fā)病。因此對(duì)多重耐藥革蘭陰性菌導(dǎo)致的醫(yī)院感染進(jìn)行流行病學(xué)及臨床研究可為控制耐藥菌傳播提供依據(jù)。本課題回顧性分析2005～2011年華山醫(yī)院共6年期間血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的臨床資料，總結(jié)院內(nèi)不動(dòng)桿菌感染的臨床特點(diǎn)、菌株敏感性與預(yù)后關(guān)系。同時(shí)對(duì)2011年3月～2012年2月華山醫(yī)院血液、腦脊液標(biāo)本分離的革蘭陰性菌進(jìn)行超廣譜β-內(nèi)酰胺酶、碳青霉烯酶

4、、甲基化酶篩查以明確上述耐藥基因的流行情況。
　　本課題共包括以下三個(gè)部分:
　　第一部分 多重耐藥革蘭陰性菌基因診斷方法的建立
　　基因芯片技術(shù)是近幾年來快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)平臺(tái)，因其具有快速、靈敏、特異、高通量、樣本用量少等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，在細(xì)菌菌種鑒定、耐藥基因檢測(cè)、基因突變及多態(tài)性、基因表達(dá)譜分析等方面均有不少探索性研究，但能否應(yīng)用于臨床常規(guī)檢測(cè)仍有不少爭(zhēng)議?；诩?xì)菌核糖體核糖核酸(

5、rRNA)基因序列中保守區(qū)和多變區(qū)相互間隔排列的特點(diǎn)，利用基因序列保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物，利用多變區(qū)設(shè)計(jì)特異性探針，使基因芯片快速鑒定細(xì)菌菌種成為可能。國內(nèi)外先后有應(yīng)用16S rRNA和23S rRNA基因檢測(cè)細(xì)菌的報(bào)道，但對(duì)于菌株的耐藥性無法得到明確的結(jié)果，難以正確指導(dǎo)臨床抗菌藥物的選擇。目前臨床上多重耐藥革蘭陰性菌中對(duì)健康威脅最大的產(chǎn)碳青霉烯酶菌株，此外甲基化酶可導(dǎo)致菌株對(duì)氨基糖苷類高度耐藥，給治療帶來極大困難。本課題在前期利用23S

6、rRNA基因快速鑒定菌種的研究基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了KPC、NDM、VIM、IMP型及OXA23、OXA51、OXA58組碳青霉烯酶耐藥基因、armA和rmtB型甲基化酶耐藥基因的PCR引物和探針，將耐藥性檢測(cè)的多對(duì)引物整合于1個(gè)PCR反應(yīng)中，然后將所有探針固定于同一張基因芯片上，通過PCR產(chǎn)物與基因芯片雜交，可一次性明確菌株產(chǎn)常見碳青霉烯酶、甲基化酶情況，期望建立起能同步完成病原及耐藥譜檢測(cè)的基因診斷方法。結(jié)果證實(shí)基因芯片用于檢測(cè)NDM、IM

7、P、KPC、OXA23、OXA51、OXA58型碳青霉烯酶耐藥基因，armA型甲基化酶耐藥基因雜交信號(hào)滿意，可重復(fù)性好。但檢測(cè)VIM型碳青霉烯酶和rmtB型甲基化酶耐藥基因雜交信號(hào)不明顯，重復(fù)性差，仍需進(jìn)一步優(yōu)化探針設(shè)計(jì)。
　　第二部分 多重耐藥革蘭陰性菌基因診斷方法的臨床研究
　　血流感染是臨床常見的重癥感染性疾病之一，具有較高的發(fā)病率及病死率，近年來發(fā)病率有上升趨勢(shì)。由耐藥菌導(dǎo)致感染的患者預(yù)后與能否及早針對(duì)病原選用敏感抗

8、菌藥物治療密切相關(guān)。為進(jìn)一步評(píng)估基因芯片檢測(cè)多重耐藥革蘭陰性菌耐藥基因攜帶情況的診斷價(jià)值，本課題收集了2011年3月～2012年2月華山醫(yī)院血培養(yǎng)機(jī)器報(bào)陽標(biāo)本356份，對(duì)其中119株革蘭陰性菌采用基因芯片進(jìn)行碳青霉烯酶和甲基化酶耐藥基因檢測(cè)，結(jié)果與PCR方法進(jìn)行比較。結(jié)果顯示基因芯片方法檢測(cè)KPC型、NDM型碳青霉烯酶耐藥基因、armA型甲基化酶耐藥基因與PCR方法的符合率為100％，檢測(cè)OXA23型、OXA51型碳青霉烯酶耐藥基因和r

9、mtB型甲基化酶耐藥基因與PCR方法的符合率分別為90.0％、80.0％和58.3％。基因芯片診斷方法所需時(shí)間約6～8小時(shí)，較常規(guī)紙片法藥敏試驗(yàn)在鑒定時(shí)間上縮短16～18小時(shí)，若同步進(jìn)行菌種鑒定及耐藥基因檢測(cè)，則較常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)+藥敏試驗(yàn)縮短2天以上，有助于指導(dǎo)臨床血流感染抗菌藥物方案的選擇。
　　第三部分 多重耐藥革蘭陰性菌醫(yī)院感染的臨床及分子流行病學(xué)研究
　　腸桿菌科細(xì)菌和不動(dòng)桿菌屬是多重耐藥革蘭陰性菌醫(yī)院感染的重要病原菌

10、。本課題收集華山醫(yī)院2005年1月～2011年12月共6年期間74例不動(dòng)桿菌血流感染、90例中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，明確不動(dòng)桿菌血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的臨床特征、抗菌治療與預(yù)后關(guān)系。結(jié)果表明不動(dòng)桿菌血流感染、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染幾乎全為醫(yī)院感染，多發(fā)生于術(shù)后及重癥患者。不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢哌酮/舒巴坦、米諾環(huán)素耐藥率較低，患者預(yù)后與不動(dòng)桿菌對(duì)抗菌藥物的敏感性密切相關(guān)。此外為了解臨床分離革蘭陰性菌中常見耐藥基因攜帶情況，本

11、課題對(duì)2011年3月～2012年2月華山醫(yī)院自血液、腦脊液分離獲得的170株革蘭陰性菌應(yīng)用PCR方法進(jìn)行KPC、NDM、VIM、IMP、GIM、SPM、OXA23、OXA24、OXA58型碳青霉烯酶耐藥基因，SHV、TEM、CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因和armA、rmtB型甲基化酶耐藥基因檢測(cè)。結(jié)果顯示:58株紙片法對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物不敏感革蘭陰性菌中有77.6％(45/58)菌株攜帶碳青霉烯酶耐藥基因。產(chǎn)KPC、OXA型碳

12、青霉烯酶是肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的主要機(jī)制。86株細(xì)菌紙片法對(duì)氨基糖苷類藥物不敏感菌株中有38.4％(33/86)菌株攜帶甲基化酶耐藥基因，甲基化酶耐藥基因也主要存在與肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中。所有170株革蘭陰性菌中PCR檢測(cè)到產(chǎn)SHV菌株26株、產(chǎn)TEM菌株24株、產(chǎn)CTX-M菌株69株，在分離前三位革蘭陰性菌中大腸埃希菌產(chǎn)ESBLs比例最高，為75.0％(27/36)。ERIC-PCR分析菌株同源性