TWIST1-FLV12介導(dǎo)TFF3下調(diào)E-CADH ERIN誘導(dǎo)結(jié)腸癌EMT.pdf

1、目的:
　　 TFF3(Trefoil Factor Family3)又稱腸三葉因子,是三葉肽家族的成員之一。它含有一個(gè)特殊的P結(jié)構(gòu)域,后者由38-39個(gè)氨基酸組成,通過6個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基經(jīng)由3個(gè)分子內(nèi)的二硫鍵相互連接使整個(gè)肽鏈扭曲折疊形成三葉狀結(jié)構(gòu),使其不受消化酶和PH變化的影響,在胃腸粘膜的損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。TFF3的高表達(dá)與結(jié)腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較差的臨床預(yù)后相關(guān),然而其機(jī)制尚不明確。我們小組在國際報(bào)道:結(jié)

2、腸癌細(xì)胞中,TFF3能夠持續(xù)上調(diào)EMT調(diào)節(jié)因子TWIST1的表達(dá)。FLV12作為轉(zhuǎn)錄因子TWIST1的靶基因,其在結(jié)腸癌的表達(dá)增高,與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們推測,TFF3可能通過上調(diào)TWIST1表達(dá)或激活其轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)而上調(diào)FLV12,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT,促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移。本研究意在探討TFF3/TWIST1/FLV12信號途徑在誘導(dǎo)結(jié)腸癌EMT,促進(jìn)其侵襲、轉(zhuǎn)移過程中可能的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 方法:
　　 1、構(gòu)建實(shí)

3、驗(yàn)相關(guān)表達(dá)載體,建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　 2、WesternBlot技術(shù)檢測TFF3在7種結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達(dá)。
　　 3、RealTimePCR、RT-PCR方法檢測TFF3對TWIST1、FLV12轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié),WesternBlot方法檢測TFF3對TWIST1、FLV12、E-CAD和FN翻譯水平的調(diào)節(jié)。
　　 4、體外GST-pulldown實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證TWIST1與FLV12、FLV12與E-CAD的相互作

4、用關(guān)系。免疫共沉淀確認(rèn)TWIST1與FLV12在體內(nèi)的相互作用。
　　 5、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析TFF3對E-CAD啟動(dòng)子活性的調(diào)節(jié)。
　　 6、干擾TWIST1表達(dá)建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系后,WesternBlot方法檢測結(jié)腸癌細(xì)胞中FLV12和E-CAD的表達(dá)。
　　 7、免疫組化檢測結(jié)腸癌中TFF3、TWIST1、FLV12蛋白表達(dá),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析三者與結(jié)腸癌病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1

5、、成功構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-5X-1-TWIST1、pGEX-SX-1-FLV12和真核表達(dá)載體pGEFP-C1-FLg12、pcDNA3.1/HisA-FLV12、pcDNA3.1/HisA-TWIST1,建立HT29/SCR、HT29/si-1W穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　 2、TFF3在7株結(jié)腸癌細(xì)胞系中均有表達(dá)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞系SW620與原發(fā)灶細(xì)胞系SW480相比,TFF3、TWIST1、FN表達(dá)增強(qiáng),E-CAD表達(dá)下降。

6、
　　 3、TFF3過表達(dá),在轉(zhuǎn)錄水平,TWIST1,FLV12mRNA的表達(dá)上調(diào);在翻譯水平,TWIST1、FLV12、FN表達(dá)增強(qiáng),同時(shí)E-CAD表達(dá)下降。
　　 4、GSTopulldown、免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)TWIST1與FLV12在體外、體內(nèi)均能相互作用,且在TFF3高表達(dá)狀態(tài)下相互作用增強(qiáng)。
　　 5、雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)證實(shí)TFF3能夠抑制E-CAD啟動(dòng)子活性。干擾TWIST1的表達(dá),其抑制作用消除。

7、
　　 6、體外GST-pulldown實(shí)驗(yàn)證實(shí)FLV12與E-CAD能夠相互作用,且TFF3能增強(qiáng)其互作。
　　 7、干擾TWIST1表達(dá),FLVl2表達(dá)下調(diào),E-CAD表達(dá)上調(diào)。
　　 8、免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn),TFF3、TWIST1、FLV12在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)明顯高于其原發(fā)灶,且三者具有相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 1、TFF3通過TWIST1/FLV12下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-