ADAM-17介導(dǎo)人結(jié)腸癌化療耐藥及腸胃清對(duì)其作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:探討ADAM-17與腫瘤化療耐藥機(jī)制的相關(guān)性，闡明腸胃清方(CWQ)逆轉(zhuǎn)奧沙利鉑(L-OHP)化療耐藥的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)采用RealTime PCR方法檢測(cè)耐藥細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株中ADAM-17mRNA表達(dá)的差異，進(jìn)而通過(guò)FCM檢測(cè)腸胃清對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，最終通過(guò)Western Blot檢測(cè)腸胃清對(duì)ADAM-17、BCL-2蛋白表達(dá)的影響的方法來(lái)揭示腸胃清方逆轉(zhuǎn)人結(jié)腸癌HCT116/L-OHP化療耐藥細(xì)胞的分子機(jī)制，為腸胃清方

2、在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:1.RealTime PCR法檢測(cè)ADAM-17mRNA在敏感細(xì)胞與耐藥細(xì)胞中表達(dá)的差異:將人結(jié)腸癌敏感細(xì)胞株HCT116和人結(jié)腸癌奧沙利鉑耐藥細(xì)胞株HCT116/L-OHP進(jìn)行體外常規(guī)培養(yǎng)，分別提取兩組細(xì)胞內(nèi)總RNA，配制RT反應(yīng)液進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，用熒光定量基因擴(kuò)增儀采用兩步法PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)而檢測(cè)ADAM-17mRNA的表達(dá)水平。2.FCM法檢測(cè)腸胃清對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響:實(shí)

3、驗(yàn)分6組:空白組，化療組，ADAM-17抑制劑組，化療+ADAM-17抑制劑組，腸胃清組，化療+腸胃清組，各組分別作用于HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞48小時(shí)，PBS緩沖液洗滌離心收集細(xì)胞兩次，加入400μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5μl Ca依賴性磷脂結(jié)合蛋白混勻后，加入碘化丙啶，4℃反應(yīng)5min后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)耐藥細(xì)胞凋亡率。3.Western Blot法檢測(cè)腸胃清對(duì)凋亡相關(guān)蛋白ADAM-17和BCL-2細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)的影響:

4、實(shí)驗(yàn)分為4組:空白組，化療組，腸胃清組，化療+腸胃清組，每組分別作用于HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞后，進(jìn)行單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取，用1mg/mL胎牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，設(shè)定空白樣品分別測(cè)定各組內(nèi)兩種蛋白的含量，最后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、顯影定影及圖像分析等步驟。
　　結(jié)果:1.RealTime PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與HCT116敏感細(xì)胞株相比較，ADAM-17在HCT116/L-OHP耐藥細(xì)胞株高表達(dá)，

5、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。2.FCM檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與化療組比較，化療+ADAM-17抑制劑組耐藥細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）;與化療組比較，化療+腸胃清組耐藥細(xì)胞凋亡率亦明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。3.Western Blot檢測(cè)方法證明，與化療組比較，ADAM-17在化療+腸胃清組的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），BCL-2在化療+腸胃清組的蛋白表達(dá)也明顯下調(diào)(P＜0.001)。<