Ⅰ、Ⅲ型膠原，雙糖鏈蛋白多糖和核心蛋白聚糖在發(fā)育性髖脫位關(guān)節(jié)囊及圓韌帶的表達(dá).pdf

1、本研究以DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶為研究對象，應(yīng)用免疫組織化學(xué)法觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在髖關(guān)節(jié)囊和圓韌帶的分布與定位；應(yīng)用分子生物學(xué)檢測技術(shù)比較Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)在轉(zhuǎn)錄水平和(或)蛋白水平的表達(dá)差異。試圖從分子水平揭示DDH患兒髖關(guān)節(jié)松弛的機(jī)理，是關(guān)節(jié)松馳導(dǎo)致DDH理論的一次深入探索。 研究材料與方法： 一、標(biāo)本采集及處理 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本33例，來源方式：手術(shù)

2、復(fù)位中經(jīng)緊縮后切除的髖關(guān)節(jié)上方多余關(guān)節(jié)囊。對照組兒童髖關(guān)節(jié)囊標(biāo)本17例。在DDH組選擇與對照組性別相同，年齡相近的9例患兒與對照組配對。 發(fā)育性髖脫位髖關(guān)節(jié)圓韌帶標(biāo)本20例，來源方式：手術(shù)復(fù)位中切除的患髖圓韌帶。對照組兒童圓韌帶標(biāo)本10例。在DDH組選擇與對照組性別相同，年齡相近的6例患兒與對照組配對。 剪取標(biāo)本為多個小組織塊：部分置于4％多聚甲醛溶液中室溫固定24小時，脫水，透明，石蠟包埋，制成5μm切片；部分置于Ep

3、pendorf管中，-80℃深低溫保存。 二、實驗方法及檢測指標(biāo) (一)免疫組織化學(xué)法(SABC法)。觀察Ⅰ、Ⅲ型膠原在DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中的定位與分布，半定量測定Ⅰ、Ⅲ型膠原含量。 (二)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅱ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan．和Decorin)轉(zhuǎn)錄水平檢測。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptionpolymerase chain reaction，R

4、T-PCR)測定COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA水平表達(dá)。 (三)髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白水平檢測。免疫印跡雜交技術(shù)(Western-Blot)檢測COL1a1、COL3a1蛋白水平表達(dá)。 三、統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，p<0.05視為統(tǒng)計學(xué)上顯著差異。應(yīng)用Pearson法進(jìn)行相關(guān)分析，配對比較采用配對T檢驗。 實驗結(jié)果：

5、 一、Ⅰ、Ⅲ型膠原的定位、分布與含量。 (一)關(guān)節(jié)囊。 1、Ⅰ型膠原貼近關(guān)節(jié)側(cè)的滑膜層呈強(qiáng)陽性表達(dá)，成纖維細(xì)胞及膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。纖維層陽性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多級性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的9例配對比較中，纖維層中有陽性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在髖脫位組與對照組間存在顯著差異(p<0.05)。 2、Ⅲ型膠原僅在DDH組纖維層中出現(xiàn)3

6、例大齡女性患兒陽性反應(yīng)：2例為成纖維細(xì)胞周圍出現(xiàn)環(huán)繞棕色深染；1例為細(xì)胞外基質(zhì)網(wǎng)狀棕色深染。 (二)圓韌帶。 1、Ⅰ型膠原。 貼近外周的圓韌帶鞘呈強(qiáng)陽性表達(dá)，膠原纖維平行滑膜緣排列規(guī)整。內(nèi)部纖維層陽性表達(dá)有所減弱，膠原纖維排列波浪樣、多極性，成纖維細(xì)胞散布其間。在性別相同，年齡相近的6例配對比較中，纖維層中有陽性表現(xiàn)的成纖維細(xì)胞數(shù)占總計數(shù)成纖維細(xì)胞的百分比及膠原染色的灰度值在DDH組與對照組間存在顯著差異(p<0

7、.05)。 2、Ⅲ型膠原。 DDH組與對照組均未見陽性反應(yīng)。 二、Ⅰ、Ⅲ型膠原和兩種小分子蛋白多糖(Biglycan和Decorin)mRNA表達(dá)差異。 (一)關(guān)節(jié)囊COL1a1、COL3a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對照組降低(p<0.01)。 (二)圓韌帶COL1a1、Biglycan和Decorin mRNA在DDH組表達(dá)較正常對照組降低(p<0.01)

8、。COL3a1無顯著差異(p>0.05)。 三、Ⅱ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)差異。 (一)關(guān)節(jié)囊COI1a1蛋白含量在DDH組較正常對照組降低(p<0.01)。COL3a1無顯著差異(P>0.05)。 (二)圓韌帶。 COL1a1蛋白含量在DDH組較正常對照組降低(p<0.01)。COL3a1無顯著差異(p>0.05)。 研究結(jié)論： 一、嬰兒期至青春期前DDH患兒髖關(guān)節(jié)囊及圓韌帶中旺盛分泌Ⅰ型膠原