αvβ受體放射性配體99Tcm-TP1326的制備、鑒定及其動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的
　　 血管生成(angiogenesis)是指由多種因子共同參與，在原有血管網(wǎng)的基礎(chǔ)上通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞芽生出新生血管的復(fù)雜過(guò)程，在腫瘤的生長(zhǎng)、侵潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中，整合素在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)與腫瘤血管生成密切相關(guān)。
　　 整合素是細(xì)胞黏附分子家族的重要成員之一，是由一條α鏈和一條β鏈以非共價(jià)鍵鏈接而成的異二聚體，以跨膜蛋白形式廣泛分布于細(xì)胞表面，主要介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間

2、(extracellular matrix，ECM)的黏附。迄今已發(fā)現(xiàn)18種α亞單位和8種β亞單位，以及由不同亞單位組成的20余種整合素，其中整合素αvβ3(αvβ3受體)在介導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的黏附、參與腫瘤血管生成、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。αvβ3受體的表達(dá)具有一定特異性，它在成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞中很少表達(dá)，但在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞和部分腫瘤細(xì)胞表面呈高水平表達(dá)，使其成為抑制腫瘤血管生成研究的新靶點(diǎn)。
　　

3、 研究發(fā)現(xiàn)，含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列的小分子多肽是一類(lèi)高效αvβ3受體拮抗劑，能夠選擇性抑制培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增值和腫瘤組織的生長(zhǎng)，其中含兩個(gè)二硫鍵的RGD多肽對(duì)腫瘤血管生成的抑制率最高。目前，用于治療惡性腫瘤的整合素抑制劑中，部分含RGD序列的小分子多肽已進(jìn)入Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)。利用放射性核素標(biāo)記含RGD序列的小分子多肽來(lái)實(shí)現(xiàn)αvβ3受體顯像及核素靶向治療已成為腫瘤分子核醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。
　　

4、 本研究通過(guò)多肽化學(xué)合成技術(shù)對(duì)自行設(shè)計(jì)的環(huán)形RGD九肽(RGD-4CK)進(jìn)行甘氨酸-丙氨酸(D)-甘氨酸-甘氨酸-γ氨基丁酸[GA(D)GG-Aba]修飾，探討99Tcm標(biāo)記GA(D)GG-Aba-RGD-4CK(TP1326)的最佳條件、標(biāo)記物的理化與生物學(xué)性質(zhì)、正常動(dòng)物體內(nèi)示蹤動(dòng)力學(xué)及組織動(dòng)態(tài)分布特點(diǎn)、荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤顯像與競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合顯像，為以整合素αvβ3為靶點(diǎn)的受體顯像研究奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法
　　 1.9

5、9Tcm-TP1326的制備：化學(xué)合成制備TP1326，并以氯化亞錫為還原劑進(jìn)行99Tcm標(biāo)記，紙層析法測(cè)定標(biāo)記率并計(jì)算比活度。
　　 2.99Tcm-TP1326的理化與生物學(xué)性質(zhì)鑒定：通過(guò)體外穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、HPLC分析、血清蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)和油/水分配實(shí)驗(yàn)，鑒定標(biāo)記物的理化與生物學(xué)性質(zhì)。
　　 3.健康大耳兔體內(nèi)示蹤動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)：取9只健康雄性大耳兔，經(jīng)耳緣靜脈注射200μ1(37 MBq)99Tcm-TP1326溶液，分別

6、于1.5、3、5、10、30、60、120、240、480 min從對(duì)側(cè)耳緣靜脈采血、稱重，γ計(jì)數(shù)儀測(cè)量放射性計(jì)數(shù)(cpm)，經(jīng)測(cè)量效率校正后計(jì)算血液放射性濃度(kBq/L)。通過(guò)藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件DAS3.1.0對(duì)房室模型進(jìn)行綜合分析、判斷，得出最佳房室模型、擬合曲線及示蹤動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
　　 4.健康大耳兔SPECT顯像研究：將健康雄性大耳兔仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，探頭視野中心對(duì)準(zhǔn)兔胸腹部。經(jīng)耳緣靜脈注射200μl(74 MBq

7、)99Tcm-TP1326溶液，立即以1幀/s采集1 min，1幀/min采集59 min，并于1.5、2、2.5、3、4h分別預(yù)置計(jì)時(shí)1.06 min、1.12 min、1.19 min、1.26 min、1.42 min采集1幀圖像，定性觀察各主要組織器官的放射性動(dòng)態(tài)分布變化。
　　 5.健康小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)：將7.4 MBq標(biāo)記物定容至500 ml，混勻后向5支放免試管中分別加入1 ml溶液，測(cè)量其放射性(cpm)，將放射

8、性計(jì)數(shù)平均數(shù)乘以500，即為參考源的放射性計(jì)數(shù)。按隨機(jī)數(shù)字表法將35只健康昆明小鼠分為7組，每組5只。經(jīng)尾靜脈注射標(biāo)記溶液200μl(7.4 MBq)，分別于1、5、10、30、60、120、240 min處死，收集血液、心、肺、肝、腎、腸、肌肉、骨、腦，分別稱重并測(cè)量其放射性，經(jīng)參考源校正后計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。繪制體內(nèi)放射性分布圖。
　　 6.荷瘤裸鼠顯像研究：將荷人黑色素瘤B16裸鼠仰臥位固定，經(jīng)尾靜脈

9、注射標(biāo)記溶液100μl(7.4 MBq)。分別于30、60、90、120、180及240 min經(jīng)時(shí)間衰減校正后各預(yù)置計(jì)時(shí)采集1幀，觀察荷瘤裸鼠體內(nèi)腫瘤組織及其他組織器官放射性的動(dòng)態(tài)分布變化，利用ROI技術(shù)測(cè)定腫瘤與對(duì)側(cè)軟組織的T/NT放射性比值。
　　 7.荷瘤裸鼠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合顯像研究：基本實(shí)驗(yàn)方法同上，不同的是先經(jīng)荷瘤裸鼠尾靜脈注射300倍非標(biāo)記TP1326(100μg)，1h后注射標(biāo)記多肽，觀察TP1326對(duì)腫瘤組織攝取99T

10、cm-TP1326的影響，評(píng)價(jià)標(biāo)記多肽與腫瘤組織結(jié)合的特異性。
　　 結(jié)果
　　 1.99Tcm-TP1326的制備：化學(xué)合成TP1326的純度為97.31%，99Tcm-TP1326的標(biāo)記率為(95.86±0.83)%，直接法計(jì)算其比活度為(38.62±0.32)TBq/mmol。
　　 2.理化與生物學(xué)性質(zhì)鑒定：標(biāo)記多肽室溫放置4h后，其放射化學(xué)純度(radiochemical purity，RCP)為(91

11、.76±2.75)%；TP1326的HPLC保留時(shí)間與99Tcm-TP1326的洗脫液放射峰值時(shí)間基本一致(約14 min)；Sephadex G50柱層析未見(jiàn)明顯蛋白結(jié)合放射峰；油/水分配系數(shù)為-(1.76±0.06)。
　　 3.健康大耳兔體內(nèi)的示蹤動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)：99Tcm-TP1326在健康兔體內(nèi)動(dòng)力學(xué)符合權(quán)重為1/c的二室模型，tl/2α、t1/2β分別為(3.115±0.771)min、(76.978±22.460)mi

12、n，清除率(CL)為(4.508±3.316)ml/min。
　　 4.健康大耳兔SPECT顯像研究：血池影消退迅速，放射性主要經(jīng)腎臟清除，腸道、胃區(qū)、頸部未見(jiàn)明顯放射性濃聚，腦呈低放射性本底影。
　　 5.健康小鼠體內(nèi)分布實(shí)驗(yàn)：注射后初期，標(biāo)記多肽放射性主要分布于血液、心臟和肝臟，并隨時(shí)間迅速下降；腎臟放射性呈持續(xù)高水平；腸道放射性并未隨肝臟放射性降低而升高；肌肉、腦組織呈持續(xù)低放射性分布。
　　 6.荷瘤裸鼠

13、顯像研究：30 min腫瘤清晰顯影，1 h時(shí)腫瘤與肌肉的T/NT比值最高，約5.26。
　　 7.荷瘤裸鼠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合顯像研究：注射顯像劑后1h，腫瘤影像明顯減淡，T/NT比值約2.83，抑制率約46.2％。
　　 結(jié)論
　　 1.本研究成功制備了標(biāo)記率高(>95%)、穩(wěn)定性好的99Tcm-TP1326，標(biāo)記方法簡(jiǎn)便，常溫下即可完成，無(wú)需分離純化可直接應(yīng)用，易于制備成一步法標(biāo)記凍干試劑盒。
　　 2.99Tc