RNAi對(duì)凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌組織中表達(dá)的影響及意義.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌（HCC）是一種惡性度極高的常見(jiàn)腫瘤，通常發(fā)現(xiàn)較晚而病情發(fā)展迅速，其發(fā)生、發(fā)展均不是十分清楚。肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，即程序性死亡，是一種由基因調(diào)控的自主性自身破壞過(guò)程，可使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、DNA斷裂和蛋白發(fā)生交聯(lián)。凋亡細(xì)胞數(shù)量減少是腫瘤產(chǎn)生的根本原因之一。 細(xì)胞增殖與凋亡失衡是腫瘤形成和發(fā)展的一個(gè)重要機(jī)制，該過(guò)程涉及多個(gè)基因的改變，并受著復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)。凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apopt

2、osis protein, IAP）家族是一類(lèi)重要的抗細(xì)胞凋亡因子，該家族結(jié)構(gòu)的共同特點(diǎn)是N端含有一個(gè)或多個(gè)串聯(lián)的桿狀病毒IAP重復(fù)序列（baculovirus IAP repeat, BIR），C端含或不含有一個(gè)環(huán)指（RING finger）結(jié)構(gòu)。FLIP是新近發(fā)現(xiàn)的IAP家族中的一個(gè)重要成員，近年來(lái)的研究表明FLIP具有強(qiáng)大的抗細(xì)胞凋亡作用，并在維持細(xì)胞有絲分裂以及血管形成過(guò)程中扮演重要角色。 FLIP（即FLICE in

3、hibitory protein，也稱(chēng)為CASH，Casper FLIP，CLARP，F(xiàn)LAMME MRI）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)含有死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（death efectdomains, DED）的凋亡抑制蛋白，在病毒、真核生物、哺乳動(dòng)物等許多物種中廣泛存在。已證實(shí)FLIP與炎癥、腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，在人類(lèi)多種常見(jiàn)腫瘤中存在高表達(dá)，提示FLIP與多種人類(lèi)腫瘤的形成和發(fā)展有著密切關(guān)系。 腫瘤細(xì)胞凋亡的減少與腫瘤的

4、發(fā)生、發(fā)展的密切相關(guān)。并且使細(xì)胞耐受放療、化療的刺激。因而，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為了一種新的殺傷腫瘤細(xì)胞的治療策略。FLIP定位于2q33-34，是一個(gè)凋亡抑制基因，屬于IAP家族。FLIP具有抑制細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂的雙重功能。它抑制凋亡的作用是通過(guò)與凋亡效應(yīng)分子caspase-8直接結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。而腫瘤細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)FLIP使其不受Fas／FasL介導(dǎo)的凋亡作用并逃避免疫監(jiān)視是腫瘤增殖、惡化的重要原因。所以可以抑制Fas、Bax、cas

5、pase分子和抗腫瘤藥物引起的凋亡。FLIP是一個(gè)天然存在的caspase-8抑制蛋白，它缺乏催化活性所必需的關(guān)鍵的半胱氨酸結(jié)構(gòu)，是Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，降低FLIP的水平可以致敏腫瘤細(xì)胞對(duì)Fas和TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。然而，調(diào)節(jié)FLIP表達(dá)的分子機(jī)制還未完全明確．因此對(duì)FLIP分子調(diào)節(jié)機(jī)制的研究將有助于進(jìn)一步了解與FLIP相關(guān)疾病的發(fā)生機(jī)制，并對(duì)臨床治療這些疾病提供一個(gè)新的思路。 RNA干涉（RNA inter

6、ference，RNAi）是一種廣泛存在于高等植物和動(dòng)物中的由雙鏈RNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因沉寂（PTGS）現(xiàn)象。外源的雙鏈RNA（dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)一種被稱(chēng)為Dicer的核酸酶的作用下，首先被剪切成含19-23個(gè)核苷酸對(duì)的小RNA片段，稱(chēng)為小干涉RNA（small interfering RNA，siRNA）。后者與Dicer和其他一些蛋白質(zhì)共同構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉寂復(fù)合物（RISC），依靠堿基互補(bǔ)規(guī)律識(shí)別與siRNA同源的mRNA分子，

7、并將它們降解。目前RNAi作為一種高效特異地抑制基因表達(dá)的新技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療等研究中。在腫瘤基因治療中，通過(guò)人工合成特定癌基因靶向的siRNA，或構(gòu)建上述siRNA的表達(dá)載體，并將它們導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞中，可以特異性地抑制目的基因的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)是利用免疫組化和RNAi技術(shù)研究FLIP在肝臟組織及肝癌組織表達(dá)和意義。 研究目的： 研究FLIP在肝臟組織及肝癌組織不同分級(jí)中的表達(dá)，并觀察人肝癌細(xì)胞H

8、epg2和SMMC-7721細(xì)胞系中siRNA對(duì)FLIP表達(dá)的抑制作用和與凋亡的關(guān)系。 研究方法： 1. 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)FLIP表達(dá)分析46例肝癌標(biāo)本，27例肝硬化組織標(biāo)本，18例肝臟血管瘤標(biāo)本，12例正常肝組織標(biāo)本，10個(gè)肝癌Hepg2細(xì)胞系細(xì)胞爬片標(biāo)本中LFIP蛋白的表達(dá)。 應(yīng)用FLIIP的抗體對(duì)上述患者的組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 2. FLIP表達(dá)與肝癌組織分級(jí)的關(guān)系分析

9、86例肝癌標(biāo)本（采用經(jīng)典的Edmondson四級(jí)分級(jí)法，I級(jí)18例，II級(jí)25例，III級(jí)21例，IV級(jí)22例），肝癌Hepg2和7721細(xì)胞系2株細(xì)胞爬片的10個(gè)樣本中FLIP蛋白的表達(dá)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較。 3. RNAi載體的構(gòu)建及鑒定根據(jù)Flip mRNA 序列，選取針對(duì)Flip mRNA526～544，1164～1182，1305～1323 處序列的3 個(gè)RNA 干擾靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成寡核苷酸序列，將合成的單鏈寡核苷

10、酸溶解退火成雙鏈DNA。pSUPER 載體用Bgl II，Hind III酶切后與上述雙鏈DNA 連接，16℃孵育過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，篩選陽(yáng)性菌落提取質(zhì)粒酶切鑒定并測(cè)序正常。 4. 重組載體干擾效率分析人肝癌細(xì)胞7721、Hepg2 與宮頸癌細(xì)胞Hela在含10g/L小牛血清的1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的7721、Hepg2 與Hela細(xì)胞，2.5g/L胰酶消化后，按一定的密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，

11、次日應(yīng)用Invitrogen 公司的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24h后傳代，加入濃度為400μg/mlG418 篩選，四周后挑取多個(gè)單集落擴(kuò)大培養(yǎng)。 對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行HE染色、透射電鏡等形態(tài)學(xué)觀察。應(yīng)用RT-PCR、間接免疫熒光法、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡、western－blot分別檢測(cè)FLIP的mRNA和蛋白的水平變化與凋亡的關(guān)系。 分別取2×106個(gè)轉(zhuǎn)染pSUPER-S1的人肝癌細(xì)胞772

12、1、Hepg2細(xì)胞和陰性對(duì)照細(xì)胞分別接種于裸鼠（各6只）皮下，進(jìn)行裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。 研究結(jié)果： 1. 肝臟組織FLIP 的表達(dá)凋亡抑制蛋白FLIP 在46 例肝癌標(biāo)本中有39 例陽(yáng)性表達(dá)（84.73％），在10 例肝癌Hepg2 細(xì)胞系細(xì)胞爬片標(biāo)本全部陽(yáng)性表達(dá)（100％），27 例肝硬化標(biāo)本中4 例陽(yáng)性表達(dá)(14.81％)，30 例肝血管瘤和正常肝組織中2 例陽(yáng)性表達(dá)（6.67％），其余均為陰性（P<0.01）。

13、 2. 不同肝癌組織分級(jí)FLIP 表達(dá)差異凋亡抑制蛋白FLIP 在86 例肝癌標(biāo)本中有72 例陽(yáng)性表達(dá)（83.72％），I級(jí)13/18（72.22％），II 級(jí)20/25（80.00％），III 級(jí)18/21（85.71％），IV 級(jí)21/22（95.45％）（P﹤0.05）；在肝癌Hepg2、7721 細(xì)胞系細(xì)胞爬片10 個(gè)樣本中全部陽(yáng)性表達(dá)（100％），（P<0.01）。 3. pSUPER重組質(zhì)粒酶切鑒定重組質(zhì)粒用B

14、glⅡ和Hind Ⅲ雙酶切，陽(yáng)性質(zhì)粒應(yīng)該能夠切下一長(zhǎng)度大約為60bp 的片斷。而對(duì)照組空質(zhì)粒（對(duì)照是針對(duì)來(lái)源于深海水母增強(qiáng)綠色熒光蛋白( EGFP)的一段序列，與人無(wú)同源性，作為無(wú)關(guān)序列對(duì)照）由于BglⅡ和Hind Ⅲ兩個(gè)酶切位點(diǎn)相鄰，不能切出片斷。酶切后用2％的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示三對(duì)siRNA 的寡核苷酸重組表達(dá)載體均有陽(yáng)性克隆。DNA 測(cè)序結(jié)果也證實(shí)重組質(zhì)粒中已插入目的片段。陽(yáng)性質(zhì)粒分別命名為pSUPER-S1、pSUPER-

15、S2、pSUPER-S3。 4. RT-PCR和Western－blot對(duì)干涉表達(dá)載體效率的鑒定在mRNA 及蛋白水平上，三個(gè)重組載體均有不同程度的干涉效果，尤其以pSUPER-S1 最為明顯，效率至少在70％以上。通過(guò)免疫組化、凋亡等功能研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、Hepg2 組部分細(xì)胞變得較大而扁平，并失去短梭形的特點(diǎn)，其它細(xì)胞形態(tài)上未見(jiàn)明顯變化。 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯

16、示，轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組增加5 倍；在熒光顯微鏡下，轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 組部分細(xì)胞核致密濃染或碎塊狀濃染，凋亡率達(dá)47.3％；透射電鏡顯示轉(zhuǎn)染pSUPER-S1 組中部分細(xì)胞存在典型的凋亡形態(tài)，而對(duì)照組凋亡細(xì)胞較少。 5. 裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)14天后對(duì)照組6只全部成瘤。4周后，對(duì)照組平均瘤體積為740mm，而轉(zhuǎn)染pSUPER-S1組僅有2只有可在皮下觸及很小的瘤體，直徑約為1.3mm，其余4只未見(jiàn)腫瘤

17、生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)染pSUPER-S1的人肝癌細(xì)胞SMMC-7721、Hepg2細(xì)胞組體內(nèi)成瘤能力顯著下降。 結(jié)論： 1. 凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌組織中陽(yáng)性表達(dá)明顯，在良性肝組織中陽(yáng)性表達(dá)不明顯。 2. 凋亡抑制蛋白FLIP在肝癌組織中呈陽(yáng)性表達(dá)；不同分化的肝癌組織其表達(dá)陽(yáng)性率不同，分化越差起陽(yáng)性表達(dá)率越高。 3.應(yīng)用RNA干涉載體，可以在細(xì)胞內(nèi)形成特異性siRNA抑制FLIP的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)