茉莉酸甲酯和蚧蟲誘導柑橘抗性基因的研究.pdf

1、柑橘(Citrus)是熱帶和亞熱帶最主要的常綠經(jīng)濟果樹，受多種害蟲危害，其中蚧蟲是一類很難防治的害蟲，造成了很大的經(jīng)濟損失。以往對柑橘蚧蟲的防治主要采用化學防治，關(guān)于柑橘抗蟲性基因的研究，特別是利用外源MeJA誘導抗性基因的研究很少有人報道。
　　本研究以盆栽柑橘(Citrus reticulata Banco)作為實驗材料，通過提取高質(zhì)量的柑橘葉片總RNA，RT-PCR擴增柑橘看家基因β-actin和茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑中起關(guān)鍵作

2、用的COI1同源基因與葉綠體ATPase基因片段。采用半定量RT-PCR的方法，研究蚧蟲危害和茉莉酸甲酯處理與柑橘葉綠體ATPase基因的表達相關(guān)性。這對于了解MeJA在柑橘中的誘導抗逆性作用機理，建立一套利用外源的JA和MeJA的誘導效應(yīng)，調(diào)控柑橘對蚧蟲的抗性，進行生物防治是非常重要的。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.柑橘葉片總RNA的提取方法研究
　　采用Trizol法，比較了天根公司的RNAplant Reagent

3、試劑和TaKaRa公司的RNAisoReagent試劑的兩種提取柑橘總RNA的方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用TaKaRa公司的RNAisoReagent提取柑橘葉片的RNA，電泳顯示28S和18S的條帶比較清晰，說明提取的總RNA質(zhì)量較好且無明顯降解。其A260/A280為1.820，介于1.7～2.0，A260/A230為2.088，大于2.0，RNA得率為2.840μgμL-1。使用天根公司的RNAplant Reagent提取的RNA，電泳

4、顯示28S和18S的條帶的帶型較模糊，并含高分子帶，即有DNA污染，DNA消化后質(zhì)量仍然不高。A260/A280為1.464，A260/A230為1.603，不能滿足后續(xù)實驗的要求。因此，本研究確定采用TaKaRa公司的RNAiso Reagen試劑提取柑橘葉片的總RNA。
　　2.柑橘β-actin看家基因擴增研究
　　柑橘葉片總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，用柑橘β-actin引物進行PCR反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物

5、條帶清晰，引物二聚體較少，片段長度均略小于250 bp，符合預(yù)期片段228 bp。柑橘看家基因β-actin的成功擴增證明此基因可以作為內(nèi)參，為進一步進行蚧蟲和茉莉酸甲酯誘導柑橘抗性基因表達和相關(guān)基因克隆研究提供了基礎(chǔ)。
　　3.柑橘COI1同源基因基因片段的擴增
　　以cDNA作模板，通過對PCR各種條件的摸索試驗，用F1和F3與F2和F3兩對引物擴增柑橘COI1同源基因片段，結(jié)果用引物F1和F3擴增出200bp左右的條帶

6、，但是與預(yù)測的片段長度相差甚遠，所以很可能是非特異的條帶。以cDNA作模板，用引物S1和S5、S2和S5、S2和S3做PCR。通過Mg2+、Taq酶的濃度梯度試驗和降落PCR試驗，結(jié)果用引物S2和S3做PCR得到長度處于250-500bp之間的片段，與預(yù)期的COI1目的基因片段大小200bp相近，所以對此擴增產(chǎn)物切膠回收，克隆測序。
　　4.PCR產(chǎn)物的序列分析
　　將測序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST分析，結(jié)

7、果是，測序序列的反向互補序列與一些植物葉綠體F-ATPase合酶CF(1)γ鏈相應(yīng)區(qū)段高度同源。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，柑橘和北美云杉均為木本植物所以親緣關(guān)系較近，煙草和菜椒均屬于茄科所以親緣關(guān)系也很近，其它植物親緣關(guān)系相差較遠。同源性比較表明，該克隆基因片段的反向互補序列與北美云杉、煙草、擬南芥、菜椒和菠菜葉綠體ATPase基因的核苷酸序列同源性分別為78.3％、77.1％、70.9％、74.3％和67.7％。因此，確定此基因片段為柑橘

8、葉綠體4TPase基因片段。
　　5.采用半定量RT-PCR的方法，檢測柑橘受褐軟蚧危害和茉莉酸甲酯誘導后，葉片中葉綠體ATPase基因的表達
　　半定量RT-PCR檢測結(jié)果表明，褐軟蚧危害后柑橘葉片內(nèi)葉綠體ATPase基因mRNA的表達量與對照相比較大，但是有的重復(fù)變化不十分明顯;茉莉酸甲酯處理以后柑橘葉片內(nèi)葉綠體ATPase基因mRNA的表達量與對照比較也相對較高，但是有時處理和對照樣本的差異不明顯，說明在重復(fù)之間有不穩(wěn)