20S蛋白酶體在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞老化中的改變及其在誘導(dǎo)衰老中的作用.pdf

1、研究背景：年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)是全球范圍內(nèi)老年人群中的主要致盲性眼病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的老化及伴隨發(fā)生的功能障礙被認(rèn)為是AMD發(fā)生中關(guān)鍵的早期病變。20S蛋白酶體在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡和調(diào)節(jié)細(xì)胞基本生理功能中具有重要作用，與細(xì)胞的老化和衰老有密切關(guān)系。已證明在多種細(xì)胞和組織的老化進(jìn)程中，20S蛋白酶體活性、含量和表達(dá)水平發(fā)生改變，這些改變具有高度的細(xì)胞和組織特異性；同時(shí)，20S蛋白酶體活性受到特異性的抑制或加

2、強(qiáng)時(shí)，可誘導(dǎo)細(xì)胞老化進(jìn)程的加速或減緩。20S蛋白酶體在人RPE細(xì)胞的老化和衰老中很可能也具有相似的效應(yīng)，但目前尚未見相關(guān)報(bào)道。
　　目的：通過檢測(cè)人RPE細(xì)胞老化中的20S蛋白酶體活性、含量和表達(dá)水平的變化，了解20S蛋白酶體的氧化蛋白質(zhì)降解功能與人RPE細(xì)胞老化間的相關(guān)性；進(jìn)一步通過特異性抑制20S蛋白酶體活性，分析其對(duì)RPE細(xì)胞老化進(jìn)程的影響及可能的機(jī)制。
　　方法：(1)參照本實(shí)驗(yàn)室已有方法，建立原代培養(yǎng)的人RPE細(xì)胞

3、體外復(fù)制衰老模型，常規(guī)傳代并記錄傳代次數(shù)，選擇第2～4代、12～14代和22～24代細(xì)胞分別作為RPE細(xì)胞體外老化的少年期、中年期和老年期細(xì)胞，對(duì)各期細(xì)胞的老化和衰老特征進(jìn)行如下鑒定：倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)特征、電子顯微鏡觀察亞細(xì)胞特征、XTT法檢測(cè)增生活性、β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)衰老細(xì)胞比例和流式細(xì)胞儀檢測(cè)自發(fā)熒光水平。(2)在經(jīng)鑒定的人RPE細(xì)胞復(fù)制衰老模型中，研究20S蛋白酶體的年齡相關(guān)性改變，包括：熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)底物法測(cè)定20S

4、蛋白酶體的降解活性，DNPH比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)氧化蛋白質(zhì)水平，westernblot檢測(cè)20S蛋白酶體的含量，細(xì)胞免疫熒光法分析RPE細(xì)胞內(nèi)的氧化蛋白質(zhì)和20S蛋白酶體的分布和相對(duì)定量，以及real-timePCR分析20S蛋白酶體活性亞基的表達(dá)水平。(3)用不同濃度的蛋白酶體特異性抑制劑MG132處理少年期RPE細(xì)胞，檢測(cè)短暫抑制、持續(xù)抑制或抑制后恢復(fù)三種情況下的RPE細(xì)胞的老化和衰老特征，并進(jìn)一步測(cè)定MG132干預(yù)后RPE細(xì)胞的蛋白酶

5、體活性和氧化蛋白質(zhì)水平，分析20S蛋白酶體活性抑制對(duì)人RPE細(xì)胞老化進(jìn)程的影響效應(yīng)及其可能的作用機(jī)理。
　　結(jié)果：(1)以少年期細(xì)胞作為對(duì)照，隨著RPE細(xì)胞體外傳代次數(shù)的增加，中年期和老年期RPE細(xì)胞部分出現(xiàn)體積變大、形態(tài)和排列失規(guī)則；電子顯微鏡觀察可見老年期的細(xì)胞胞漿中有空泡形成、塵樣致密物聚集和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)模糊等改變；同時(shí)細(xì)胞增生活性明顯降低，β-半乳糖苷酶染色陽性細(xì)胞比例顯著增加，細(xì)胞內(nèi)自發(fā)熒光水平升高。提示人RPE細(xì)胞經(jīng)過重

6、復(fù)的體外傳代后逐漸老化，具備衰老表型。(2)蛋白酶體活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，老年期RPE細(xì)胞中20S蛋白酶體的PGPH、CT-L和T-L三種特異性水解活性較少年期均顯著降低，蛋白酶體對(duì)FITC-酪蛋白的降解能力也減弱至少年期細(xì)胞活性的50％左右。蛋白酶體功能的削弱伴隨著細(xì)胞內(nèi)氧化蛋白質(zhì)水平顯著升高，然而，細(xì)胞內(nèi)20S蛋白酶體的含量無顯著改變。進(jìn)一步的細(xì)胞免疫熒光定位和定量分析提示，RPE細(xì)胞內(nèi)的氧化蛋白質(zhì)隨著老化由細(xì)胞核周區(qū)域重分布至核內(nèi)，老化相

7、關(guān)的氧化蛋白質(zhì)水平升高在細(xì)胞核周區(qū)域和核內(nèi)最為顯著；而20S蛋白酶體的分布始終以細(xì)胞核內(nèi)為主。20S蛋白酶體比氧化蛋白質(zhì)的比率反映了蛋白酶體的水解效率，少年期RPE細(xì)胞核中這一比率的值最大，到老年期降低至不到50％，而細(xì)胞漿中的這一比率較為低且穩(wěn)定。實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示RPE細(xì)胞中，20S蛋白酶體β5亞基的基因表達(dá)隨老化呈雙相改變，老年期表達(dá)水平顯著降低，分別是少年期和中年期的83％和68％。(3)亞毒性劑量的MG132處理后，年輕R

8、PE細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的生長停滯、形態(tài)和排列失規(guī)則、胞漿空泡化和β-半乳糖苷酶染色增強(qiáng)的衰老表型，這一誘導(dǎo)衰老效應(yīng)具有劑量和時(shí)間依賴性。進(jìn)一步的蛋白酶體功能檢測(cè)和細(xì)胞內(nèi)氧化蛋白質(zhì)定量分析提示，5μM濃度的MG132首先抑制RPE細(xì)胞中的PGPH活性和CT-L活性，并顯著降低20S蛋白酶體對(duì)FITC標(biāo)記酪蛋白的降解能力，但T-L活性對(duì)這一濃度的MG132較為不敏感。同時(shí)，這一濃度的MG132并不引起RPE細(xì)胞內(nèi)氧化蛋白質(zhì)水平的明顯增加。10μ

9、M濃度的MG132可顯著抑制蛋白酶體的3種水解活性，并使RPE細(xì)胞內(nèi)的氧化蛋白質(zhì)含量顯著升高。
　　結(jié)論：(1)體外培養(yǎng)的RPE細(xì)胞經(jīng)過重復(fù)多次的傳代后表現(xiàn)出典型的衰老表型，提示RPE細(xì)胞的復(fù)制衰老模型可用于老化和衰老相關(guān)研究；(2)人RPE細(xì)胞中的20S蛋白酶體功能隨著老化而降低，伴隨細(xì)胞內(nèi)氧化蛋白質(zhì)含量升高。這一蛋白酶體功能的老化相關(guān)性減弱可能是活性亞基的表達(dá)水平改變和/或發(fā)生氧化性修飾造成的。RPE細(xì)胞中的20S蛋白酶體集中

10、分布在細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核內(nèi)的蛋白酶體降解效率隨老化顯著降低，提示蛋白酶體在細(xì)胞核中的作用與RPE細(xì)胞的老化進(jìn)程關(guān)系最為密切。(3)蛋白酶體特異性抑制劑MG132可誘導(dǎo)年輕RPE細(xì)胞出現(xiàn)不可逆的衰老表型，這一誘導(dǎo)效應(yīng)的原因至少包括氧化蛋白質(zhì)聚集和蛋白酶體對(duì)多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)障礙，后者所占的比重很可能超過預(yù)期，仍待進(jìn)一步探索。
　　總之，我們的實(shí)驗(yàn)提示蛋白酶體在RPE細(xì)胞老化、功能失調(diào)和AMD的發(fā)病中具有重要的調(diào)節(jié)效應(yīng)。這些研究結(jié)果目前尚