人源20S蛋白酶體激活因子REGγ結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、蛋白酶體是普遍存在于古菌，真核生物以及一些細(xì)菌中的一種降解蛋白質(zhì)的復(fù)合物，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著重要的作用。目前關(guān)于蛋白酶體激活機(jī)制的研究主要包括兩個(gè)方面:泛素化及ATP依賴的蛋白酶體激活途徑;非泛素化及ATP依賴的蛋白酶體激活途徑。
　　Smurf1與Smurf2是泛素-蛋白酶體途徑中的一種泛素連接酶E3，屬于C2-WW-HECT家族的泛素連接酶，在蛋白質(zhì)泛素化中起著重要的作用，同時(shí)在骨的分化以及RhoA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中也起著關(guān)鍵的作

2、用。Smurf2中的C2結(jié)構(gòu)域與HECT結(jié)構(gòu)域通過分子內(nèi)的相互作用而抑制其自身的連接酶活性，但是關(guān)于Smurf1-C2結(jié)構(gòu)域的功能還不是很清楚。因此本論文通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)對(duì)Smurf1-C2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究，為以后更深入了解其重要功能奠定了基礎(chǔ)。
　　REG家族是一種不依賴于泛素化及ATP激活蛋白酶體酶活性的蛋白酶體激活因子，通過結(jié)合到桶狀蛋白酶體的末端來激活其特異的蛋白酶活性。其中REGγ只能特異性的激活蛋白酶體降解堿性氨基酸形成的

3、肽鍵，而且是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種能激活蛋白酶體降解完整蛋白（如p21，SRC-3）的激活因子。所研究的Smurf1蛋白是最近被報(bào)道通過REGγ-蛋白酶體途徑進(jìn)行降解的。同時(shí)REGγ在細(xì)胞周期，細(xì)胞凋亡，病毒感染，癌癥的發(fā)生及其他人類疾病中都起著重要的作用。因此通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段對(duì)REGγ進(jìn)行研究，進(jìn)而揭示出REGγ激活蛋白酶體的重要機(jī)制。
　　本論文的第一部分的研究?jī)?nèi)容是對(duì)Smurf1-C2結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了晶體學(xué)及細(xì)胞功能學(xué)的研究，通

4、過X射線衍射獲得并解析了分辨率為2(A)的Smurf1-C2三維結(jié)構(gòu)。其空間結(jié)構(gòu)由典型的反平行β片層組成，并結(jié)合有兩個(gè)硫酸根離子以及一個(gè)氯離子，通過對(duì)頂端硫酸根結(jié)合位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)重要的氨基酸殘基:K28與K85。繼而通過定點(diǎn)突變及細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)證明:Smurf1-C2結(jié)構(gòu)域?qū)τ赟murf1在細(xì)胞中的定位起著非常重要的作用，并非像Smurf2-C2對(duì)Smurf2-HECT的分子內(nèi)自抑制作用;同時(shí)證明Smurf1-C2與細(xì)胞膜的結(jié)合方式

5、是非鈣離子依賴型的。
　　本論文的第二部分的研究?jī)?nèi)容為解析了分辨率為3(A)的REGγ七聚體的結(jié)構(gòu)，同時(shí)解析了突變體REGγ-linker的結(jié)構(gòu)，即用人工六肽(GAVSAG)來取代REGγ蛋白序列中60位到107位的氨基酸殘基。通過對(duì)REGγ-linker結(jié)構(gòu)分析，蛋白酶體的激活實(shí)驗(yàn)以及細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)表明:60位到107位柔性區(qū)不影響REGγ的空間結(jié)構(gòu)及對(duì)蛋白酶體酶活性的激活，但使RE研的定位從細(xì)胞核中轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞質(zhì)中，揭示出該區(qū)域

6、含有核定位信號(hào)。
　　本論文的第三部分的研究?jī)?nèi)容是對(duì)突變體REGγ-linker(K188E)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了解析，通過對(duì)其結(jié)構(gòu)分析以及與REGγ結(jié)構(gòu)的比對(duì)發(fā)現(xiàn)蛋白酶體激活區(qū)域(143位到152位氨基酸殘基)和結(jié)合蛋白酶體的C末端均發(fā)生了重要的構(gòu)象變化:E鏈和D鏈中150位的甘氨酸構(gòu)象都發(fā)生了改變。通過定點(diǎn)突變及蛋白酶體激活實(shí)驗(yàn)證明，150位的甘氨酸以及148位的谷氨酸在REGγ激活蛋白酶體酶活性中起著非常關(guān)鍵的作用，同時(shí)研究還進(jìn)一步揭