紫杉醇聯(lián)合淫羊藿提取物經Caco-2細胞轉運機制及藥代動力學研究.pdf

1、紫杉醇能促進細胞微管形成并能阻止其生理解聚，從而避免了癌細胞的快速分裂，使其停止在G2期和M期，直到死亡。它具有廣譜抗腫瘤活性，特別對治療轉移性卵巢癌、乳腺癌療效顯著，被公認為非常有發(fā)展前途的抗癌藥物。但紫杉醇口服吸收較差，故臨床采用紫杉醇注射液，但該注射液含有50％的增溶劑(cremophor EL，聚氧乙烯蓖麻油)，在體內可引起較嚴重的急性過敏反應，且發(fā)生率較高。 制約紫杉醇口服制劑發(fā)展的重要原因是紫杉醇在動物體內口服吸收差

2、。因此，許多研究機構在水溶性、穩(wěn)定性和生物利用度方面做了不同程度的改善，并嘗試開發(fā)新劑型與新給藥途徑，如關節(jié)腔注入、多聚型配方、環(huán)糊精包合物、脂質體、靜脈乳等。但到目前為止仍沒有一種制劑可以完全取代紫杉醇注射液。 進一步的研究證實，消化道膜P糖蛋白(P-gp)作用和肝細胞色素P450代謝酶是導致紫杉醇吸收差的主要原因。P-gp是由ATP水解而始動的能量依賴的底物外向轉運泵，能將底物轉運出細胞，從而降低細胞內底物濃度。而作為P-g

3、p底物的紫杉醇，將被過度表達的P-gp主動泵出，使紫杉醇在腫瘤細胞內的積累減少，產生耐藥性，導致治療失敗。Van Asperen等證實環(huán)孢素A具有阻滯P-gp作用，并且為肝細胞色素P450 3A4代謝酶的底物，與紫杉醇同服后可通過雙重機制阻滯作用，增加藥物的吸收和延緩代謝。但由于環(huán)孢素A具有免疫抑制作用，使其作用受到限制。 淫羊藿提取物，是從小蘗科淫羊藿屬植物莖葉中提取的多種黃酮類成分，具有促進免疫功能、參與骨代謝，抗腫瘤、增強

4、心血管活動、補腎壯陽、延緩衰老等多方面的藥理作用。此前的研究中，中山大學藥學院自行提取和分離了數種淫羊藿提取物，并發(fā)現其中的幾種成分，具有很好的抑制P-gp活性作用。而它們是否可用于提高紫杉醇的口服吸收，值得進一步研究。 在本研究中，我們建立了Caco-2細胞單層模型并進行了驗證，應用Caco-2模型對淫羊藿提取物進行初步篩選后，再進行大鼠體內藥代動力學的研究。 基于以上所述，本實驗分為以下四個部分： 1.含4％

5、BSA的HBSS及大鼠血漿中紫杉醇HPLC分析方法的建立； 2.Caco-2細胞單層模型的驗證； 3.紫杉醇聯(lián)合淫羊藿提取物在Caco-2細胞單層模型中的轉運研究； 4.紫杉醇聯(lián)合淫羊藿提取物在大鼠體內的藥代動力學研究。 第一部分： HBSS及大鼠血漿中紫杉醇HPLC分析方法的建立。 目的：建立含4％BSA的HBSS及大鼠血漿中紫杉醇的HPLC分析方法。 方法：含4％BSA的HBSS樣品及

6、血漿樣品以叔丁基甲醚(3：1，v/v)進行液．液萃取，取有機層，真空揮干后甲醇重溶，HPLC進樣分析。色譜條件：流動相為甲醇．乙腈．水(23：37：40)，含0.5％冰醋酸。內標物：地西泮(Diazepam)，終濃度20μg·mL-1。流速：1 ml·min-1。色譜柱：Hypersil ODS C18色譜柱(150mm×4.6 mm,5μm)。柱溫：室溫。紫外檢測波長：227 nm。 結果：含4％BSA的HBSS中標準曲線范圍

7、為0.078 gg μg·mL-1～20 μg·ml-1，回歸方程為：y=0.1785x+0.016，r2=0.9998；提取回收率為80.5％～90.7％(n=5)，方法回收率為95.7％～99.1％，RSD≤10.9％(n=5)；批內RSD ≤6.48％，批間RSD ≤13.47％。血漿中標準曲線范圍為0.017 μg·mL-1～5 μg·mL-1，回歸方程為：y=0.296x-0.0134，R2=0.9986；提取回收率為46.5

8、％～60.9％(n=5)，方法回收率為95.7％～104.9％，RSD ≤ 11.4％(n=5)；批內RSD ≤ 4.24％，批間RSD ≤12.54％. 結論：本分析方法靈敏、準確、重復性好，為紫杉醇非臨床藥代動力學研究中樣品的檢測提供了可靠的方法。 第二部分：Caco-2細胞單層模型的驗證。 目的：建立Caco-2細胞模型，驗證其在藥物吸收研究方面的可靠性。 方法：按照文獻報道方法，將細胞接種在12

9、孔Transwell(ComingCostar，Cambridge，MA，LISA)板上，接種密度為每孔2×105，。Yranswell板BL側加入DMEM培養(yǎng)液1.5 mL，第一周隔天換液，一周后每天換液。培養(yǎng)約21天后，采用熒光黃、普萘洛爾、維拉帕米三種標準的標記物，在模型中進行轉運試驗。對模型的完整性、通透性以及P-gp的表達進行驗證，將結果與文獻報道值比較。 結果：細胞旁轉運的標記物熒光黃表觀滲透系數值(Papp)為6.

10、3×10-6 cm·sec-1，在文獻報道值范圍之內?？缂毎粍愚D運的標記物普萘洛爾的Papp值為24.0×10-6cm·sec-1，與文獻報道值接近。P-gp的標準底物維拉帕米在模型中的外排能被P-gp的強抑制劑酮康唑抑制，P<0.05。 結論：本研究建立的Caco-2細胞單層模型在模型完整性、通透性以及P-gp的表達方面能夠滿足化合物在小腸吸收研究的需要。 第三部分：淫羊藿提取物聯(lián)合紫杉醇在Caco-2細胞模型中的研

11、究。 目的：研究淫羊藿提取物對紫杉醇在Caco-2細胞模型中吸收的影響。 方法：用Caco-2細胞單層模型研究紫杉醇的雙向轉運，并考察不同淫羊藿提取物和P-gp抑制劑維拉帕米及酮康唑對紫杉醇吸收的影響。用HPLC法檢測藥物濃度，并計算其Papp，計算外排比率(Efflux ratio)。 結果：不同濃度的紫杉醇在Caco-2細胞模型中，從腸腔側(AP)到基底膜(BL)的Papp為2.38～8.59×10-6 cm

12、·sec-1；從Caco-2單層細胞基底膜(BL)到腸腔側(AP)的表觀滲透系數為18.12～94.06×10-6cm·sec-1BL側→AP側的Papp值為AP側→BL側的7.6～10.9倍。3小時內AP側→BL側的藥物吸收隨時間和濃度的增加無飽和趨勢，P-gp抑制劑維拉帕米、酮康唑、淫羊藿提取物A、B、Y能使紫杉醇的外排比率分別降低至48.4％、65.2％、69.4％、85.6％和86.7％。 結論：在Caco-2細胞模型中

13、，紫杉醇AP側→BL側的轉運受到的P-gp的外排作用，可被P-gp抑制劑維拉帕米、酮康唑、淫羊藿提取物所抑制。在淫羊藿提取物中，提取物A的抑制效果最佳。 第四部分：淫羊藿提取物聯(lián)合紫杉醇在大鼠體內的藥代動力學研究。 目的：研究淫羊藿提取物A對大鼠體內紫杉醇藥代動力學的影響，并探討其原因。 方法：空白對照組，SD大鼠單次灌胃給予紫杉醇混懸液(30 mg·kg-1)。淫羊藿提取物A組，灌胃給予淫羊藿提取物A30 mi