菊花提取物效應成分的代謝及動力學研究.pdf

1、菊花(Flos Chrysanthemi)為菊科菊屬植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的頭狀花序。據(jù)《本草綱目》、《本草疏經(jīng)》記載,菊花具有疏散風熱、明目、平肝潛陽、清熱解毒之功效?，F(xiàn)代藥理學研究表明,菊花提取物(Chrysanthemum morifolium extracts,CME)具有治療心血管系統(tǒng)疾病的作用。進一步的研究證明,菊花提取物主要功效與其所含的黃酮類化合物密切相關。因此,系統(tǒng)研究

2、菊花中黃酮類化合物的體內過程,特別是研究其效應成分藥動學及其體內外的吸收動力學特征,對于選擇合適的劑型、優(yōu)化給藥方案,具有重要的意義。研究表明,菊花提取物(CME)經(jīng)口給予后,體內主要效應成分為木犀草素和芹菜素。因此,本研究主要以木犀草素和芹菜素為研究對象,建立兩者的生物樣本分析方法,并用建立的HPLC方法考察不同動物經(jīng)口給予菊花提取物后,木犀草素和芹菜素的藥動學差別,并觀察其在不同動物腸道的吸收、腸道菌群的代謝和肝臟微粒體代謝等情況,

3、初步了解CME在不同種屬動物的吸收、代謝、排泄等方面的差異性,以期為該類藥物的開發(fā)提供新的思路和方法,并為臨床合理用藥和科學評價CME的動物藥效學、藥動學及毒理學提供重要依據(jù)。
　　第一章菊花提取物效應成分的藥動學研究
　　1.菊花黃酮及其水解產物效應成分在家兔體內動力學研究
　　目的:建立兔血漿中木犀草素和芹菜素的HPLC分析方法,并比較家兔口服菊花提取物(CME)及其酸水解產物后血漿中效應成分(木犀草素和芹菜素)的

4、濃度,計算其動力學參數(shù),從而闡明菊花黃酮不同給藥形式對其生物利用度和藥動學參數(shù)的影響。
　　方法：健康家兔灌胃CME及其酸水解產物(200 mg/kg，n=3)，于不同時間取血，肝素抗凝，離心得血漿，用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）測定血漿中木犀草素和芹菜素的藥物濃度，3P87軟件擬合血漿藥物濃度．時間曲線，并計算藥動學參數(shù)，Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。
　　結果：家兔灌胃CME及其酸水解產物后

5、，血漿中木犀草素濃度較高，其藥代動力學過程符合一室模型，而血漿中芹菜素濃度在定量限以下。兩種形式給予家兔灌胃后，所得木犀草素藥代動力學參數(shù)表明：與原型CME比較，以其水解產物給家兔灌胃，木犀草素在其體內的血藥濃度達峰時間Tmax略滯后，最高血藥濃度Cmax有所降低，而平均滯留時間MRT有所延長。但經(jīng)t檢驗統(tǒng)計分析，兩種形式給藥，在家兔血漿的木犀草素濃度和AUC無顯著性差異（P>0.05）。
　　結論：以原型CME或其水解產物給健康

6、家兔灌胃，即CME中黃酮類化合物以苷或苷元的形式給藥，藥動學特征無統(tǒng)計差異。
　　2．CME效應成分在大鼠體內的線性動力學研究
　　目的：研究CME效應成分在大鼠體內的動力學特征及考察其線性動力學的劑量范圍。
　　方法：SD大鼠（雄性）隨機單盲法灌胃不同劑量CME（100，200和400mg/kg及耐受劑量12 g/kg，n=5），于不同時間尾靜脈取血，離心得血漿，經(jīng)酸水解后HPLC測定血漿中總體木犀草素和芹菜素的藥物

7、濃度。
　　結果：大鼠灌胃lOOmg/kg CME后，血漿中木犀草素和芹菜素藥代動力學過程均符合一室模型，而灌胃200-400mg/kgCME后，兩者均符合二室模型；木犀草素和芹菜素在100-400mg/kg劑量范圍內Cmax和AUCo-∞隨劑量的增加成線性增加：當大鼠給予12g/kg的耐受劑量時，并未出現(xiàn)嚴重的不可逆的不良反應。
　　結論：大鼠灌胃CME100-400mg/kg劑量范圍內，效應成分木犀草素和芹菜素呈線性動力

8、學過程，且在耐受劑量（12g/kg）以內都有很好的安全性。
　　3．Beagle犬長期經(jīng)口給予菊花提取物后體內動力學研究
　　目的：研究Beagle犬連續(xù)高低劑量經(jīng)口給予CME9個月后，木犀草素和芹菜素的代謝動力學特征。
　　方法：Beagle犬連續(xù)給藥CME(102和918mg/(kg-day)，n-3)
　　9個月后，不同時間隱靜脈取血，以HPLC測定血漿中總木犀草素和芹菜素濃度，并計算藥代動力學參數(shù)。

9、>　　結果：Beagle犬連續(xù)給予CME9個月后，血漿中木犀草素濃度遠遠高于芹菜素；經(jīng)3P87軟件模擬血漿藥時曲線，給918mg/(kg-day)CME時木犀草素和芹菜素的藥代動力學過程均符合一室模型，102mg/(kg-day)CME時兩者均符合二室模型：兩者的Cmax和AUCo-∞隨劑量的增加而增加，但與劑量不成
　　比例關系；連續(xù)給藥9個月后，木犀草素和芹菜素在犬體內無累積現(xiàn)象出現(xiàn)。
　　結論：Beagle犬連續(xù)給藥C

10、ME(102和918mg/(kg.day》9個月后，大體上兩組動物并無顯著性差異，并且無嚴重不可逆的不良反應產生。
　　4．CME效應成分在人體內的藥代動力學和尿藥排泄研究
　　目的：研究CME效應成分在人體血漿和尿液的動力學過程以及了解兩者的尿液排泄率，為臨床合理用藥提供依據(jù)。
　　方法：健康志愿者(n=8)口服CME片 （20mg/kg）后，于不同時間取血并收集尿液，血漿經(jīng)酸水解，尿液經(jīng)β-葡萄糖醛酸酶/硫酸酯酶

11、水解后，RP-HPLC分別測定木犀草素和芹菜素的血藥及尿藥濃度，并計算兩者各自的尿藥總排泄率。
　　結果：健康志愿者口服CME片劑后，血漿中木犀草素和芹菜素的藥代動力學過程均符合二室模型，且兩者的Tmax都<1.0h：經(jīng)混合酶水解后，尿液中芹菜素濃度高于木犀草素，在12h內兩者的尿藥總排泄率分別為2.30％和6.09%。
　　結論：健康志愿者口服CME片后，吸收較快，在血漿中藥物消除較緩慢，12h后人尿中木犀草素和芹菜素累積

12、排泄率較小，提示硫酸根或葡萄糖醛酸苷結合物僅占總代謝物的一小部分，或者尿液排泄不是CME代謝的主要途徑。
　　第二章菊花提取物腸道處置研究
　　1．腸道菌群對菊花提取物的代謝作用
　　目的：觀察和比較人、大鼠、Beagle犬及家兔腸道菌群對菊花提取物的代謝作用。
　　方法：健康人、大鼠、Beagle犬及家兔的新鮮糞便厭氧孵育液中加入一定量CME，置于37℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)，經(jīng)乙酸乙酯提取后以HPLC/LC-MS方

13、法對代謝成分進行分離和定性定量分析。
　　結果：CME容易被腸道菌群代謝，經(jīng)LC-MS檢測，主要的代謝物為木犀草素和芹菜素；隨著代謝時間的延長，兩者均出現(xiàn)降解代謝現(xiàn)象；且人、大鼠和Beagle犬腸道菌對CME的代謝較快，而家兔腸道菌對CME的代謝過程比較平緩。
　　結論：在離體厭氧培養(yǎng)條件下，CME可以被人、大鼠、Beagle犬及家兔的腸內菌代謝，主要的代謝物為木犀草素和芹菜素。
　　2．菊花提取物水解產物在動物外翻腸

14、囊的吸收動力學研究
　　目的：運用外翻腸囊法研究和比較CME水解產物效應成分木犀草素和芹菜素在不同種屬動物的腸吸收動力學過程。
　　方法：采用大鼠及家兔外翻腸囊為體外吸收模型，在Kreb氏溶液中于37℃水浴通混合氣體(95%C02+5%02)孵育一定時間后，采用HPLC法測定腸囊內液中木犀草素和芹菜素的濃度，并用腸段表面積為校正因子，計算兩動物腸段的吸收速率常數(shù)(KR)和表觀滲透系數(shù)（Papp）。
　　結果：在大鼠和家

15、兔腸道中，木犀草素和芹菜素的吸收速率常數(shù)K。分別為：0.0185、0.0253min.1和0.0186、0.0091min-1；表觀滲透系數(shù)Papp分別為：3.941x10-5、1.051×l0-5cm/min和10.15X10-5、2.443×10-5cm/min。
　　結論：木犀草素和芹菜素在大鼠腸道比在家兔腸道吸收強，且芹菜素吸收強于木犀草素，這與體內芹菜素Cmax高于木犀草素Cmax的藥動學結果相一致。經(jīng)t檢驗統(tǒng)計分析，芹

16、菜素在兩種腸道的吸收具有顯著性差異(P<0.01)。
　　第三章菊花提取物在肝微粒體中的代謝研究
　　1.動物肝微粒體對CME水解產物的代謝作用
　　目的：研究和比較Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體對CME水解產物效應成分芹菜素的代謝作用以及酶代謝動力學特征。
　　方法：鈣鹽沉淀法制備Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體后，10.μg/mL CME水解產物與肝微粒體酶(0.3-0.8mg/mL)在37℃水浴中孵育

17、不同時間(5-15min)后，用HPLC法測定孵育液中芹菜素的濃度，以選擇實驗最佳酶蛋白濃度和孵育時間；不同濃度的CME水解產物(10.0-200μg/mL)與三種動物肝微粒體孵育一定時間后，測定孵育液中芹菜素的濃度，并用所測濃度與反應速度做Lineweave-Brurk雙倒數(shù)曲線，推導出芹菜素在不同動物肝微粒體中的酶促動力學參數(shù)。
　　結果：當Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體酶蛋白濃度分別為0.5mg/mL、0.3mg/mL和

18、0.3 mg/mL時，三種微粒體對芹菜素代謝的最佳孵育時間分別為10 min、5min和5min。芹菜素在Beagle犬、家兔和大鼠肝微粒體中代謝的Vm和Km分別為0.1970±0.010μg/mg/min和3.608±0.62μg/mL，0.8924±0.051μg/mg/min和4.363±0.46μg/mL，0.3274±0,061 μg/mg/min和3.599±0.62υg/mL。
　　結論：CME水解產物（10.0-2