基于風(fēng)險決策的眼刺激性評價組合替代方法的研究.pdf

1、研究背景及目的
　　化學(xué)物質(zhì)引起的局部眼刺激作用，通常涉及結(jié)膜、角膜、虹膜和淚腺的刺激效應(yīng)，以角膜的刺激作用為首，其次是結(jié)膜、虹膜。傳統(tǒng)的眼刺激作用，采用動物試驗進(jìn)行評價，鑒于其備受質(zhì)疑的合理性和倫理性，此法已不能滿足當(dāng)前產(chǎn)品風(fēng)險評估和法規(guī)管理的需要?；隗w內(nèi)眼刺激作用發(fā)生的機(jī)制，目前已開發(fā)了多種替代動物試驗的方法。單一體外方法可較好地模擬復(fù)雜眼損傷作用中的某個方面，但如何組合使用，以滿足實際工作需要，尚有待深入研究。因此，有必要

2、根據(jù)角膜損傷的發(fā)生機(jī)制，結(jié)合體外方法的原理和標(biāo)準(zhǔn)化應(yīng)用程度，對目前眼刺激實驗的諸多替代方法的科學(xué)性和適用性進(jìn)行評估。在此基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗?zāi)康?，建立成組的體外方法策略，以完全取代動物測試，滿足風(fēng)險決策和安全評價的需要。
　　本研究建立雞胚尿囊膜絨毛膜苔盼藍(lán)染色實驗(Chicken Chorioallantoic Membrane- Trypan Blue Staining，CAM-TBS）、紅細(xì)胞溶血實驗（Red blood cel

3、l haemolysis test，RBC）和SIRC細(xì)胞短時暴露實驗（Short-term exposure，STE）三種眼刺激實驗替代方法，并評估其單獨或組合用于風(fēng)險決策系統(tǒng)的科學(xué)性和局限性。為下一步建立眼刺激實驗體外替代方法的組合模式提供支持。以滿足替代動物實驗的法規(guī)要求，也為產(chǎn)品安全性評價的風(fēng)險決策提供資料。是今后推動我國眼刺激評價的體外標(biāo)準(zhǔn)化檢測方法的鋪墊。
　　研究方法
　　1、雞胚尿囊絨毛膜苔盼藍(lán)染色實驗（CA

4、M-TBS）
　　該實驗利用雞胚絨毛膜尿囊膜結(jié)構(gòu)與人結(jié)膜相似的特點，在定性觀察的基礎(chǔ)上，建立定量檢測的方法。通過觀察化合物作用于CAM引發(fā)出血、血管溶解和凝血反應(yīng)的損傷程度，并測定CAM吸收臺盼藍(lán)的量，從而定量檢測受試物損傷作用，提高了實驗的可重復(fù)性。
　　2、紅細(xì)胞溶血實驗（RBC）
　　通常具有眼刺激作用的物質(zhì)也能使蛋白質(zhì)變性或細(xì)胞膜溶解。將化合物直接接觸哺乳動物的紅細(xì)胞，通過定量檢測紅細(xì)胞溶血，以及釋放出細(xì)胞外的

5、血紅蛋白變性程度，模擬類似角膜的損傷作用。
　　3、SIRC細(xì)胞短時暴露實驗（STE）
　　化合物直接作用于角膜引起的刺激作用類似于細(xì)胞毒性損傷作用。通過檢測細(xì)胞毒性指標(biāo)，可反應(yīng)角膜損傷的程度。實驗采用體外培養(yǎng)的兔角膜細(xì)胞（SIRC），短期暴露細(xì)胞于化合物，模擬急性角膜刺激作用，計算細(xì)胞活性、生長的抑制程度，及其與化學(xué)物的濃度-效應(yīng)關(guān)系。
　　4、提出替代方法的組合策略
　　基于危害物質(zhì)風(fēng)險評估的基本理論與原則，

6、在參考國內(nèi)外眼刺激試驗最新法規(guī)認(rèn)可與標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)展的基礎(chǔ)上，提出以三種替代方法為主體的眼刺激試驗風(fēng)險評估組合策略。
　　實驗結(jié)果
　　1、雞胚尿囊絨毛膜苔盼藍(lán)染色實驗（CAM-TBS）
　　苔盼藍(lán)濃度與吸光度OD值間存在正相關(guān)，回歸模型表達(dá)式為
　　y=0.2968+0.0004x
　　回歸系數(shù)的區(qū)間估計：95％CI=[0.0002，0.0005]。R2=0.8994，表明利用苔盼藍(lán)濃度變量可以解釋吸光度OD值變

7、異情況的89.94%。
　　2、紅細(xì)胞溶血實驗（RBC）
　　對RBC實驗與Draize實驗的受試物分類做配對資料的Wilcoxon符號秩和檢驗，得S=1.8182，p=0.9976，在檢驗水準(zhǔn)α=0.05的水平下，兩者之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。經(jīng)一致性檢驗，得出Kappa=0.6356，置信區(qū)間為[0.3930,0.8781]；RBC實驗和Draize兔眼實驗結(jié)果的一致性較好。
　　3、 SIRC細(xì)胞短時暴露實驗（S

8、TE）
　　SIRC細(xì)胞短時暴露實驗（STE）所分的結(jié)果，與 Draize兔眼實驗分類結(jié)果相比較，經(jīng)過kappa一致性檢驗，kappa值=0.6316，95%可信區(qū)間為[0.4040,0.8592]，兩種分類一致性較好。
　　4、替代方法組合試驗策略
　　本組合適用于無刺激性到嚴(yán)重刺激性范圍內(nèi)眼刺激危害性的評價，對于無刺激性到中等刺激性的區(qū)分優(yōu)勢明顯，三種方法組合流程見下圖。
　　根據(jù)受試物的理化特性，預(yù)期為有刺

9、激性的物質(zhì)先進(jìn)行CAM-TBS測試，若測試結(jié)果為嚴(yán)重刺激性，則可直接分類為嚴(yán)重刺激性；若測試結(jié)果為非嚴(yán)重刺激性，則進(jìn)行細(xì)胞短期暴露測試或紅細(xì)胞溶血試驗，若為表面活性劑或含表面活性劑配方，則進(jìn)行紅細(xì)胞溶血試驗，其它物質(zhì)則選擇細(xì)胞短期暴露試驗，根據(jù)試驗結(jié)果可對受試物眼刺激性分類。
　　預(yù)期為無刺激性的物質(zhì)，若為可溶性物質(zhì)或配方，先進(jìn)行細(xì)胞短期暴露測試，若測試結(jié)果為無刺激性，則可直接分類為無刺激性；若為表面活性劑或含表面活性劑配方，則需

10、要補(bǔ)充紅細(xì)胞溶血試驗加以確認(rèn)或直接用此法進(jìn)行測試。若結(jié)果有刺激性，則進(jìn)行CAM-TBS測試，確認(rèn)并區(qū)分刺激的嚴(yán)重程度。
　　結(jié)論
　　本研究選擇CAM-TBS、RBC和STE三種眼刺激實驗替代方法，模擬結(jié)膜和角膜受損的機(jī)制，在改進(jìn)試驗材料和試驗方案的基礎(chǔ)上，探索建立替代實驗組合。實驗結(jié)果與Draize兔眼實驗結(jié)果相比，這三種方法的體內(nèi)相關(guān)性、分級一致性和結(jié)果重現(xiàn)性均良好。
　　三種方法均可定量檢測化合物的眼刺激性。并且

11、三者適用于不同的化合物，化合物的眼刺激性分類范圍也不同。對于嚴(yán)重刺激性物質(zhì)，CAM-TBS實驗分類較好；中等/溫和刺激性物質(zhì)分類，RBC實驗分類較好；弱/無刺激性物質(zhì)分類，STE實驗分類較好。CAM-TBS實驗可用于測試單一化合物或混合物，該方法不適合用于有色嚴(yán)重刺激性物質(zhì)的分類。RBC實驗與 STE實驗適用于可溶解性物質(zhì)的檢測，但不適用于難溶物質(zhì)或混合物的測試，且前者對表面活性劑更敏感。
　　綜合考慮三種方法的優(yōu)點和局限性，初步