自噬溶酶體途徑在大鼠腦永久性缺血損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞死亡中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：觀察大鼠永久性局灶性缺血性腦損傷對(duì)自噬一溶酶體的激活，探討抑制自噬溶酶體途徑對(duì)大鼠永久性局灶性缺血性腦損傷的保護(hù)作用，以及對(duì)抗凋亡蛋白Bcl-2的作用。 方法：采用線拴法制作大鼠永久性大腦中動(dòng)脈梗塞(permanent middle cerebralarteryr occlusion，pMCAO)模型。用電鏡觀察大鼠永久性局灶性缺血性腦損傷對(duì)自噬-溶酶體的激活。3-MA(150-600 nmol)，cmhepsin B i

2、nhibimr(CBI)(5-10μg)側(cè)腦室注射給藥，以腦梗塞體積、腦水腫、行為學(xué)癥狀等指標(biāo)評(píng)價(jià)對(duì)缺血性腦損傷的影響。采用western blot法和免疫組化法檢測pMCAO大鼠缺血半球皮層中自噬溶酶體相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：電鏡觀察顯示缺血早期的神經(jīng)細(xì)胞，即可發(fā)現(xiàn)自噬小體產(chǎn)生，溶酶體電子密度增加，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹，在缺血后期，鏡下神經(jīng)細(xì)胞表現(xiàn)為凋亡或壞死。3-MA(300和600 nm01)或CBI(7.5和

3、10 μg)均可顯著改善pMCAO行為障礙，減小腦梗塞體積，減輕腦水腫(P<0.05)。Western blot及免疫組化結(jié)果顯示，腦缺血0h、1h、3h、6h、12h、24h后，大鼠大腦缺血半球皮層內(nèi)LC3和cmhepsin B的表達(dá)(P<0.05)可在短期內(nèi)迅速增加，在3h達(dá)到高峰，6h表達(dá)仍較高，但表達(dá)已開始減弱(P<0.05)。同時(shí)還檢測了Beclin 1的表達(dá)水平，在1h就迅速升高，達(dá)到峰值，3h表達(dá)仍然較高(P<0.05)。

4、選擇3h作為給藥時(shí)間點(diǎn)，同樣觀測L,C3、Beclin 1和cathepsin B的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)給予3．MA(600 nmol)或CBI(10μg)能顯著降低LC3、Beclin 1和cathepsin B的表達(dá)(P<0.05)，減少永久性局灶性缺血損傷引發(fā)的細(xì)胞死亡，有神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)我們還檢測了該時(shí)間點(diǎn)的Bcl-2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表達(dá)水平降低(P<0.05)，但給與3-MA(600 nmol)或CBI(10μg)后，能使Bcl-2的

5、表達(dá)恢復(fù)至正常水平(P<0.05)。 結(jié)論： 1．大鼠局灶性缺血性腦損傷能激活自噬一溶酶體發(fā)生，且早于凋亡和細(xì)胞壞死前發(fā)生。 2．大劑量和中劑量3-MA對(duì)大鼠局灶性缺血性腦損傷有一定的保護(hù)作用。 3．大劑量和中劑量CBI對(duì)大鼠局灶性缺血性腦損傷有一定的保護(hù)作用。 4．3-MA和CBI對(duì)大鼠局灶性缺血性腦損傷的保護(hù)作用，可能是通過抑制LC3、cathepsin B等的表達(dá)，即通過抑制自噬一溶酶體途徑