T淋巴細(xì)胞活化相關(guān)的microRNA的篩選、靶分子的預(yù)測(cè)、構(gòu)建和鑒定.pdf

1、microRNA簡(jiǎn)稱miRNA，是一種21-25個(gè)堿基的非編碼小分子RNA，它廣泛存在于真核生物中。miRNA基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(pri-miRNA)在細(xì)胞核中被RNaseⅢDrosha切割成為前體miRNA(pre-miRNA)，pre-miRNA在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白exportin-5的作用下由核內(nèi)轉(zhuǎn)到胞質(zhì)中，然后由另一種RNaseⅢDicer進(jìn)一步切割產(chǎn)生成熟的miRNA。這些成熟的miRNA與其他蛋白質(zhì)一起組成RISC(RNA-induc

2、edsilencingcomplex)復(fù)合體，從而引起靶mRNA的降解或者翻譯抑制。miRNA廣泛存在于動(dòng)物、植物以及病毒中，第一個(gè)被確認(rèn)的是在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)的lin-4和let-7，隨后多個(gè)研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個(gè)miRNAs。截止2008年9月，登載在SangermiRNA數(shù)據(jù)miRBase12.0(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中的miRNA總數(shù)已

3、達(dá)8273種。大量研究表明，miRNA參與了包括細(xì)胞分裂增殖、分化與發(fā)育以及代謝等許多重要的生物學(xué)過程。
　　哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)在抵抗感染、自身穩(wěn)定和免疫監(jiān)視方面發(fā)揮重要作用。為達(dá)到免疫應(yīng)答和免疫耐受的恰當(dāng)平衡,免疫反應(yīng)的起始、終止和反應(yīng)強(qiáng)度必須被嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)節(jié)。相對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子全開或全關(guān)的調(diào)節(jié)方式，miRNAs更適合對(duì)免疫系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)和定量調(diào)節(jié)，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^非常短的作用位點(diǎn)進(jìn)行調(diào)節(jié)，在作用位點(diǎn)一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)堿基對(duì)就能起到關(guān)鍵作用，并

4、且由于它們?cè)谶M(jìn)化過程中易于突變，從而為生物體提供了隨病原進(jìn)化同時(shí)發(fā)揮作用的基因調(diào)節(jié)子儲(chǔ)存庫(kù)。最近研究表明miRNAs確實(shí)在免疫系統(tǒng)的精細(xì)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。深入理解miRNA調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的機(jī)制，不僅有助于鑒定調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的新靶標(biāo),而且有助于建立有效的miRNA新療法。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，為了探詢T細(xì)胞活化是否對(duì)miRNA的表達(dá)譜產(chǎn)生影響，我們應(yīng)用ExiqonmiRNA基因表達(dá)譜芯片，以活化的Jurkat細(xì)胞（用CD3抗體和CD28抗

5、體雙信號(hào)活化）為實(shí)驗(yàn)組，未活化Jurkat細(xì)胞為對(duì)照組，分析了二者miRNA表達(dá)譜的差異，找出表達(dá)水平顯著改變（下調(diào)超過2倍）的miRNA。芯片結(jié)果顯示，與未活化的Jurkat細(xì)胞相比，活化的Jurkat細(xì)胞中有一些miRNA表達(dá)水平明顯下調(diào)。我們對(duì)部分下調(diào)的miRNA進(jìn)行了實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)來驗(yàn)證芯片的結(jié)果。
　　為了進(jìn)一步確實(shí)miRNA和人T淋巴細(xì)胞活化的關(guān)系，我們通過miRanda來預(yù)測(cè)miRNA在T細(xì)胞活化過程中的潛在作用

6、位點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行驗(yàn)證。預(yù)測(cè)結(jié)果表明：miR-33b和miR-568對(duì)T細(xì)胞活化過程中的許多重要分子都有作用位點(diǎn)，這些分子包括CD96、CD28、NF1、CD3G、IL2RA、IL2RB、NFAT5、CD8B、RAC3等。其中，miR-568的靶分子NFAT5在預(yù)測(cè)的靶分子的評(píng)分中，分?jǐn)?shù)最高，并且miR-568和NFAT5有4個(gè)潛在作用的位點(diǎn)，說明NFAT5很有可能是miR-568針對(duì)的一個(gè)靶分子。
　　為了驗(yàn)證這些預(yù)測(cè)的靶

7、分子是否為miRNA真正作用的靶標(biāo)，我們將預(yù)測(cè)的靶分子的3′UTR序列中miRNA結(jié)合位點(diǎn)上下游的部分片段導(dǎo)入pGL3-MCS2熒光素酶表達(dá)載體中，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)，然后分別將miRNA真核表達(dá)質(zhì)?；蚝铣傻膍iRNA以及對(duì)照pcDNA3或合成的陰性對(duì)照scramblemiRNA（N.C.）與構(gòu)建好的靶分子真核表達(dá)載體、質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，觀察熒光素酶活性的變化。結(jié)果顯示：miR-568對(duì)NFAT5有比較明顯的抑