催化合成茶氨酸的菌株篩選與重組菌的構(gòu)建.pdf

1、茶氨酸(Theanine)是1950年首次從綠茶中分離得到的，是茶葉中的特征氨基酸，也是茶葉的呈味物質(zhì)之一，具有很好的生理功能和商業(yè)價(jià)值。其制備研究是目前茶學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。由于從茶葉中提取高純度的茶氨酸，成本高昂；化學(xué)合成茶氨酸工藝較復(fù)雜；組織培養(yǎng)合成茶氨酸產(chǎn)量低。開展茶氨酸的生物合成研究具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。本論文針對茶氨酸的微生物發(fā)酵法制備技術(shù)，開展了菌株篩選和工程菌構(gòu)建兩方面工作，將生物技術(shù)運(yùn)用到天然產(chǎn)物制備技術(shù)中。本

2、論文通過比較不同微生物催化L-谷氨酰胺(L-Gln)和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力大小，對微生物進(jìn)行了篩選，明確了9種微生物催化合成茶氨酸的能力；通過基因克隆技術(shù)構(gòu)建了重組菌，優(yōu)化了重組菌催化合成茶氨酸的條件，重組菌株酶活達(dá)到出發(fā)菌株的15倍，茶氨酸產(chǎn)量達(dá)到29.40g/L。主要研究結(jié)果如下： 1、對9種微生物催化L-谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力進(jìn)行了測試，發(fā)現(xiàn)它們催化合成茶氨酸的能力都很低。茶氨酸的最大生成量僅為7.9mg/

3、L。 2、以培養(yǎng)好的EscherichiacoliDH5α(E.coliDH5α)菌液為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，將擴(kuò)增出的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因片斷和載體pET-32a相連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-GGT，將重組質(zhì)粒pET-GGT轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中，構(gòu)建重組菌。重組菌株經(jīng)0.05mMIPTG在32℃誘導(dǎo)后，SDS-PAGE結(jié)果顯示出明顯的特征蛋白質(zhì)條帶。經(jīng)酶活性檢測，重組菌株每克濕菌體的酶活達(dá)到2.0U/ml左右，約是出發(fā)菌株E

4、.coliDH5α的15倍。 3、本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了重組菌催化L-谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的反應(yīng)條件，重組菌經(jīng)37℃培養(yǎng)2h左右，然后再加IPTG至0.05mM于32℃誘導(dǎo)表達(dá)4h收集菌體。1ml反應(yīng)體系(含0.35ML—谷氨酰胺、2.0M鹽酸乙胺、70mg/ml菌體、pH9.5)于30℃培養(yǎng)4小時(shí)，茶氨酸的最大生成量為29.40g/L，即每克濕菌體可催化合成茶氨酸的量為420g/L。L-Gln轉(zhuǎn)化率為48.22％。Suzuki等

5、報(bào)道的用構(gòu)建的重組菌催化谷氨酰胺(Gln)和乙胺合成茶氨酸的量為20.90g/L，Gln轉(zhuǎn)化率為60％。本實(shí)驗(yàn)中的L-Gln轉(zhuǎn)化率稍低，但是茶氨酸產(chǎn)量有所提高。 本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組菌具有較好的催化L—谷氨酰胺和鹽酸乙胺合成茶氨酸的能力，可以嘗試用其進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)茶氨酸小試實(shí)驗(yàn)，可以嘗試將本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同表達(dá)載體系統(tǒng)中，以尋找更適合γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶大量表達(dá)的載體系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)對于微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)茶氨酸等方面的工作具有