茶氨酸產(chǎn)生菌的選育.pdf

1、茶氨酸是茶葉中特有的氨基酸，它除了在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理、生化功能外，對(duì)人和動(dòng)物還具有很好的保健功能和藥理作用，因此不僅可以作為食品和保健品中的添加劑，而且在醫(yī)藥行業(yè)有潛在的應(yīng)用前景。對(duì)茶氨酸工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)的研究相對(duì)薄弱，已經(jīng)成為限制茶氨酸進(jìn)一步推廣應(yīng)用的最重要因素。微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)茶氨酸被認(rèn)為是最適合茶氨酸工業(yè)化生產(chǎn)的方法，微生物轉(zhuǎn)化方法主要采用了兩種酶（γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、谷氨酰胺合成酶）來生產(chǎn)茶氨酸。以γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶生產(chǎn)茶氨酸的

2、方法較為成熟。目前在茶氨酸商業(yè)生產(chǎn)國日本，采用的γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶主要來自經(jīng)基因工程改造后的大腸桿菌，國內(nèi)對(duì)γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶生產(chǎn)茶氨酸的研究集中在采用大腸桿菌基因工程菌進(jìn)行表達(dá)。采用γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶工業(yè)生產(chǎn)菌株-地衣芽孢桿菌生產(chǎn)茶氨酸，目前尚未見公開報(bào)道。 本研究的主要目的是篩選得到產(chǎn)γ－谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的可合成茶氨酸的微生物菌株，對(duì)其進(jìn)行誘變育種，選育出一株高產(chǎn)茶氨酸的菌株，并對(duì)其產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為今后利用微生物轉(zhuǎn)化方法工業(yè)化

3、生產(chǎn)茶氨酸提供依據(jù)。主要研究結(jié)果如下: 1.對(duì)國家標(biāo)準(zhǔn)的茚三酮比色法和紙層析法兩種常用的測(cè)定方法進(jìn)行了研究。國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T8314法不能排除樣品中其他氨基酸對(duì)測(cè)定的干擾；紙層析法能把茶氨酸和其它氨基酸分離出來，并且紙層析斑點(diǎn)較規(guī)整、清晰，分離效果也比較好。將紙層析的茶氨酸斑點(diǎn)萃取后定量測(cè)定，茶氨酸濃度在0.0016～0.0040mg/ml范圍內(nèi)與光密度OD值呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y=59.125x+0.0032，R2=0

4、.9936。經(jīng)茶氨酸Rf值鑒定，說明這種方法是穩(wěn)定可靠的。從而確立紙層析法為大規(guī)模菌株篩選的茶氨酸檢測(cè)方法。 2.從地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、放射形土壤桿菌、根癌土壤桿菌、野油菜黃單孢菌、產(chǎn)氨短桿菌這七種γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶產(chǎn)生菌，通過比較發(fā)酵液的酶活力和轉(zhuǎn)化液的茶氨酸產(chǎn)量，篩選地衣芽孢桿菌為合成茶氨酸的菌株。 3.采用致死率為99.0％，即照射時(shí)間為60s的誘變劑量對(duì)地衣芽孢桿菌進(jìn)行誘變，從稀釋分離

5、后培養(yǎng)的平板上挑選200株單菌落進(jìn)行初篩，然后挑取50株進(jìn)行復(fù)篩，再篩選10株，通過遺傳穩(wěn)定性考察再復(fù)篩，得到1株茶氨酸產(chǎn)量為18.57g/L的菌株Bacillus licheniformis C12，較出發(fā)菌株提高了66.19％。 4.通過對(duì)突變株Bacillus licheniformis C12產(chǎn)酶條件優(yōu)化研究：18 h的種齡，裝液量為30ml，搖床轉(zhuǎn)速為180r/min，接種量為10％，初始pH值為7.2，培養(yǎng)溫度為3