重型肝炎相關(guān)基因的RNA干擾質(zhì)粒的構(gòu)建及其體內(nèi)外干預(yù)效應(yīng)的研究.pdf

1、背景及目的:
　　 HBV感染在全世界范圍的流行都非常嚴(yán)重，尤其是在發(fā)展中國(guó)家和亞太地區(qū)，我國(guó)是HBV感染高發(fā)地區(qū)，人群攜帶率高達(dá)約10～20%。在亞洲，重型肝炎最主要是由HBV感染引起的，而在歐美國(guó)家重型肝炎主要是由酒精性肝炎和藥物性肝炎引起。重型肝炎是急驟發(fā)生廣泛性肝細(xì)胞壞死而引起重度肝功能障礙，出現(xiàn)以肝性腦病為主的肝功能衰竭癥狀之高危疾病。該病病情嚴(yán)重，發(fā)展迅猛，發(fā)病機(jī)制尚不明了，臨床缺乏上特異、有效的治療靶點(diǎn)和干預(yù)手段，

2、除非實(shí)施緊急肝移植，絕大部分患者預(yù)后不良。因此探索重型肝炎肝細(xì)胞死亡機(jī)制，并開(kāi)發(fā)針對(duì)其發(fā)病機(jī)制、阻斷病理衍變過(guò)程的基因治療手段正在成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和發(fā)展方向。
　　 肝細(xì)胞過(guò)度凋亡引起的肝損傷可以引起肝衰竭，并在多種肝病的發(fā)生過(guò)程中起重要作用。在生理狀態(tài)下發(fā)生的凋亡主要是清除那些損傷的和多余的細(xì)胞,凋亡小體的吞噬不伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生。而在病理狀態(tài)下，肝細(xì)胞凋亡則有可能引起炎癥反應(yīng),出現(xiàn)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)、肝星狀細(xì)胞活化,發(fā)生肝

3、臟纖維化。在重型肝炎的發(fā)病過(guò)程中，F(xiàn)as與TNFα系統(tǒng)的激活會(huì)促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。肝細(xì)胞的凋亡途徑包括胞膜上死亡受體介導(dǎo)的外部途徑和線粒體介導(dǎo)的內(nèi)部途徑，肝細(xì)胞膜上表達(dá)最廣泛的死亡受體是CD95 (APO21PFas)和TNF2a 受體1 (CD120a)。多項(xiàng)研究表明,急慢性肝病中肝細(xì)胞的凋亡一般由死亡受體介導(dǎo)。肝細(xì)胞對(duì)CD120a和CD95介導(dǎo)的凋亡具有高度的敏感性。體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)。在LPS+D-GalN誘導(dǎo)的爆發(fā)性肝衰竭

4、模型中，LPS的毒性實(shí)際上是由于嚴(yán)重的凋亡性肝損傷和肝細(xì)胞完全破壞所引起的。然而，有關(guān)肝細(xì)胞凋亡在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠重型肝炎肝衰竭中的重要作用還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此研究肝細(xì)胞凋亡及其調(diào)控機(jī)制對(duì)重型肝炎肝損傷發(fā)生機(jī)理的理解具有重要意義。TNFα是一種由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。TNFα對(duì)不同的細(xì)胞類型發(fā)揮各種不相同的作用，在許多重要的病理和生理過(guò)程下作為一重要的介質(zhì)存在。而且TNFα
　　 還是凋亡的重要介質(zhì)之一,TNFα的大多

5、數(shù)生物學(xué)效應(yīng)TNFR1介導(dǎo)。TNFR1 胞內(nèi)區(qū)含死亡結(jié)構(gòu)域，可引起細(xì)胞凋亡或者通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子NF-KB 使某些細(xì)胞增殖、分化，另外也可觸發(fā)信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
　　 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指特異性針對(duì)目標(biāo)基因的同源雙鏈RNA(double-strain RNA，dsRNA)的導(dǎo)入引起目的基因不表達(dá)或減效表達(dá)，具有高效、特異，快速等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。前期研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)尾靜脈高壓注射可

6、以使質(zhì)粒DNA在小鼠肝臟高效表達(dá)。尾靜脈高壓注射可將大體積的裸質(zhì)粒DNA 溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速注入，大量的質(zhì)粒溶液導(dǎo)致循環(huán)血量的急劇增加，超過(guò)心臟負(fù)荷，血液積聚在肝竇中不能回流，延長(zhǎng)了質(zhì)粒DNA 在肝竇中的停留時(shí)間，從而被肝組織細(xì)胞攝取。因此該方法可以廣泛應(yīng)用于肝臟疾病基因干預(yù)的研究。從基因水平沉默“有害”高表達(dá)的基因可以更好地闡明該基因在疾病的發(fā)生發(fā)展中重要作用，也為探索人類重型肝炎臨床治療方法提供新的思路和手段。
　　 具體

7、研究目的如下：
　　 1. 針對(duì)重型肝炎發(fā)病關(guān)鍵基因mTNFR1 構(gòu)建siRNA干擾質(zhì)粒，在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）中可以明顯抑制TNFR1基因的表達(dá)。
　　 2. 研究mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒對(duì)重型肝炎小鼠體內(nèi)mTNFR1表達(dá)的抑制，改善肝細(xì)胞的凋亡情況，生化指標(biāo)以及對(duì)小鼠重型肝炎病情發(fā)展的影響。
　　 3. 針對(duì)凋亡相關(guān)基因Fas，TNFR1 構(gòu)建其真核表達(dá)載體和microRNA表達(dá)載體，并研究在mi

8、RNA 在細(xì)胞水平對(duì)基因表達(dá)的抑制作用。
　　 方法:
　　 1. 構(gòu)建mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和非相關(guān)對(duì)照質(zhì)粒，細(xì)胞水平分別共轉(zhuǎn)染mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pCDNA3.0-TNFR1，并通過(guò)顯微鏡下觀察熒光，RT-PCR、Western blot 技術(shù)檢測(cè)mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒的體外干預(yù)效應(yīng)。
　　 2. 采用MHV-3感染Balb/

9、cJ小鼠制造重型肝炎動(dòng)物模型；通過(guò)尾靜脈高壓注射將目的基因?qū)胄∈蟾闻K，并檢測(cè)目的基因在肝臟的表達(dá)效率；mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒高壓注射后，檢測(cè)小鼠肝組織病理、血清生化學(xué)變化，并觀察重型肝炎小鼠生存率的改變；通過(guò)Real-time PCR、免疫組化檢測(cè)mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒干預(yù)后的小鼠肝臟mTNFR1的表達(dá)情況；用TUNNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡情況的改變，并計(jì)算凋亡指數(shù)。
　　 3. 構(gòu)建人類Fas和TNFR1基因的

10、真核表達(dá)載體及其miRNA表達(dá)載體，并將其共轉(zhuǎn)染至人293T細(xì)胞，通過(guò)Real-time PCR和western blot檢測(cè)在細(xì)胞水平對(duì)基因表達(dá)的抑制作用。
　　 結(jié)果:
　　 1. 成功構(gòu)建mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和非相關(guān)對(duì)照質(zhì)粒，并鑒定無(wú)誤；分別共轉(zhuǎn)染mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pEGFP-TNFR1，mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒和pCDNA3.0-TNFR1至CHO細(xì)胞，鏡下可見(jiàn)干預(yù)后熒光明顯減弱，R

11、T-PCR、Western blot結(jié)果證實(shí)mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒細(xì)胞水平顯著抑制mTNFR1的表達(dá)。
　　 2. 尾靜脈高壓注射可以將目的基因?qū)胄∈蟾闻K，24h 重復(fù)注射可以使表達(dá)效率提高到40%。mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒高壓注射后，重型肝炎小鼠生存率從0 提高到13.3%，并顯著改善肝組織病理學(xué)變化和血清學(xué)指標(biāo)；mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒高壓注射后，顯著抑制mTNFR1 在重型肝炎小鼠模型體內(nèi)的表達(dá)，并顯

12、著減少肝細(xì)胞的凋亡。
　　 3. 成功構(gòu)建人類凋亡相關(guān)基因Fas，TNFR1的真核表達(dá)載體和miRNA干擾質(zhì)粒，并鑒定無(wú)誤；Fas-miRNA和TNFR1-miRNA干擾質(zhì)粒在細(xì)胞水平顯著抑制hFas和hTNFR1的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1. 本研究利用在線軟件設(shè)計(jì)合成針對(duì)小鼠TNFR1基因的RNA干擾靶序列，通過(guò)PCR將其連接于 pMSCV-U6 載體，并通過(guò)序列鑒定無(wú)誤。構(gòu)建成功的的mTNFR1shRN

13、A干擾質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)可以有效且特異地下調(diào)目的基因的表達(dá)。
　　 2.建立MHV-3誘導(dǎo)的重型肝炎小鼠模型，并通過(guò)尾靜脈高壓注射技術(shù)將外源基因高效導(dǎo)入小鼠肝臟，mTNFR1shRNA干擾質(zhì)粒通過(guò)下調(diào)小鼠肝臟TNFR1基因的表達(dá)可以顯著提高小鼠的生存時(shí)間和生存率，并且生化指標(biāo)和肝臟的炎癥均得到明顯改善。為今后重型肝炎、腫瘤、代謝性疾病等凋亡相關(guān)的疾病治療提供了一條新途徑。
　　 3. 重型肝炎的肝細(xì)胞死