人促血管生成素-2基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及其抑制人膠質(zhì)瘤體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 人促血管生成素-2(Ang-2)基因RNA干擾(RNA1)慢病毒載體的構(gòu)建和鑒定 目的:構(gòu)建Ang-2基因RNAi慢病毒載體，為其體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。 方法:合成Ang-2基因的miRNA干擾序列，構(gòu)建pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR-Ang2質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證插入序列完全正確，連接到慢病毒載體pLenti6/v5-Dest中，獲得pLenti6/v5-DestmiRNA-Ang2質(zhì)粒，與慢

2、病毒包裝質(zhì)粒VIRAPOWERMIX、Lipofectamine2000共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝產(chǎn)生慢病毒顆粒，測(cè)定慢病毒滴度。結(jié)果PCR擴(kuò)增和測(cè)序 結(jié)果:證實(shí)，Ang-2miRNA核苷酸鏈序列插入正確，包裝慢病毒產(chǎn)生病毒懸液的滴度為8.26×107TU/ml。 結(jié)論:成功構(gòu)建人Ang-2基因RNAi慢病毒載體，為研究其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的生物學(xué)功能和基因治療奠定基礎(chǔ)。 第二部分促血管生成素-2(Ang-2)RNA干擾

3、慢病毒表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251體外生長的抑制實(shí)驗(yàn) 目的:促血管生成素-2(Ang-2)RNA干擾慢病毒表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251后觀察Ang-2、VEGF蛋白的表達(dá)，研究其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251體外生長的抑制作用。 方法:應(yīng)用Ang-2RNAi慢病毒載體、空載體分別轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251細(xì)胞株，以未轉(zhuǎn)染組為對(duì)照，培養(yǎng)后，應(yīng)用MTT法分析細(xì)胞生長抑制作用，ELISA檢測(cè)Ang-2蛋白的表達(dá)，

4、Westernblot分析VEGF蛋白的表達(dá)。 結(jié)果:MTT檢測(cè)表明Ang-2轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞生長速度減慢，陽性轉(zhuǎn)染組Ang-2及VEGF蛋白的表達(dá)較空載體組和對(duì)照組均明顯減少。 結(jié)論:慢病毒載體對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞有著很高的感染效率，介導(dǎo)的RNAi可顯著抑制靶基因的表達(dá)與活化，是對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞基因功能研究的理想工具。人膠質(zhì)瘤細(xì)胞Ang-2基因受抑制后細(xì)胞生長顯著變慢，其亦可能抑制VEGF的表達(dá)。 第三部分促

5、血管生成素-2(Ang-2)RNA干擾慢病毒表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251成瘤性和血管生成的影響 目的:觀察促血管生成素-2(Ang-2)RNA干擾慢病毒表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251成瘤性和血管生成的影響。 方法:將Ang-2RNAi慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251。將24只裸鼠隨機(jī)分為三組，分別用未轉(zhuǎn)染的、轉(zhuǎn)染Ang-2RNAi慢病毒載體的、轉(zhuǎn)染空載體的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251注射于裸鼠皮下產(chǎn)生腫瘤