MEKK2參與和調(diào)制T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及皮質(zhì)激素對(duì)人肺成纖維細(xì)胞MAPK的作用.pdf

1、一、MEKK2參與T細(xì)胞受體信號(hào)中JNK激活和IL-2基因表達(dá) JNK(c-Jun N-terminal kinases)是MAPK(mitogen-activated protein kinase)家族基因的成員,對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡十分重要.以前的研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞JNK激活需要T細(xì)胞受體和輔助受體如CD28的共刺激.該研究探討MEKK2是否是T細(xì)胞中特異的JNK上游活化激酶,是否涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)自TCR/CD3的T細(xì)胞信號(hào)激活JNK MA

2、PK級(jí)聯(lián)和T細(xì)胞特異基因IL-2的表達(dá).利用多組織poly(A)雜交模板,用1kb N-末端人MEKK2做探針行Northern雜交.Jurkat T-細(xì)胞用電擊法轉(zhuǎn)染,COS-1細(xì)胞用Lipo-fectamine轉(zhuǎn)染檢測(cè)不同的基因表達(dá)或作用.抗JNK抗體免疫沉淀法,GST-cJun為作用底物體外檢測(cè)JNK激酶活性;抗HA抗體、GST-JNKK2為作用底物體外檢測(cè)MEKK2激酶活性.熒光酶報(bào)告基因檢測(cè)IL-2和AP—1基因的表達(dá).抗HA

3、抗體12CA5、抗MEKK2抗體11281129、抗磷酸化抗體Pty20和ECL試劑盒進(jìn)行蛋白印跡檢測(cè).二、小鼠MEKK2基因損毀揭示其在T細(xì)胞受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起特殊調(diào)制作用 MEKK2是絲裂原蛋白激酶(MAPK)激酶的激酶基因家族成員,涉及調(diào)節(jié)多條MAPK信號(hào)途徑.MAPK可以被特異的MAPKK在保守的蘇氨酸和酪氨酸上雙磷酸化而激活,MAPKK則由MAPKKK來(lái)激活.為了闡明MEKK2在體內(nèi)的功能,我們制備了攜帶靶向突變MEKK2基因座

4、的小鼠,并進(jìn)行了系列分析.基因打靶制備MEKK2缺陷小鼠,Southern雜交、PCR方法檢測(cè)基因型.免疫沉淀和蛋白印跡方法分析MEKK2的表達(dá).制備純化T細(xì)胞,熒光抗體常規(guī)染色標(biāo)記,流式細(xì)胞儀分析T細(xì)胞和B細(xì)胞亞群.ELISA方法測(cè)定細(xì)胞因子IL—2、IL—4、IL—5、IL—10和IFN—r.小鼠腹腔注射抗CD3單抗或?qū)φ湛贵w,檢測(cè)體內(nèi)胸腺細(xì)胞凋亡.體外分別用抗CD3單抗、抗Fas抗體、地塞米松和紫外線誘導(dǎo)凋亡,PI和FITC—An

5、nexinV雙染檢測(cè).免疫印跡法檢測(cè)磷酸化JNK、ERK和p38,膜經(jīng)洗脫抗體后再進(jìn)行常規(guī)JNK、ERK和p38蛋白印跡分析.三、激素對(duì)人肺成纖維細(xì)胞MAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑的作用 激素是控制代謝、發(fā)育、炎癥、細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控分子.已知激素對(duì)多種組織和細(xì)胞如淋巴組織、成纖維組織和上皮來(lái)源細(xì)胞等具有抗增殖作用,臨床上常常利用其抗炎作用治療肺間質(zhì)性疾病.但是皮質(zhì)激素導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞周期停滯和生長(zhǎng)抑制,及其信號(hào)傳導(dǎo)通路依然不清楚.為了探討MA