CCR3、CCR5及其配體在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠中的表達(dá)分析.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種嚴(yán)重威脅人類健康和生命的慢性炎癥疾病。AS的發(fā)展過(guò)程是緩慢而復(fù)雜的，從血脂代謝紊亂、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、炎癥細(xì)胞侵入、泡沫細(xì)胞形成以及血管平滑肌細(xì)胞游走、增殖，到脂質(zhì)條紋、纖維斑塊乃至粥樣斑塊的形成過(guò)程中炎癥反應(yīng)起著重要的作用，目前對(duì)AS的早期發(fā)病機(jī)制還不明確，往往是血脂異常、糖代謝失衡以及炎癥等多種危險(xiǎn)因素并存，共同影響著AS的發(fā)生發(fā)展。
　　趨化因子(chemokine)是細(xì)

2、胞因子家族中的一員，趨化因子通過(guò)與受體的結(jié)合參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡等多種生理功能，并在多種生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，如炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷修復(fù)、病原體感染以及腫瘤的形成和轉(zhuǎn)移等。趨化因子及其受體作為聯(lián)系氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)的紐帶，通過(guò)受體介導(dǎo)的趨化作用和細(xì)胞間的黏附機(jī)制，參與AS的多個(gè)過(guò)程，如炎性細(xì)胞的募集與浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞的滯留與逸出、血管平滑肌細(xì)胞的激活與增殖等過(guò)程。研究趨化因子及其受體網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)機(jī)制將為動(dòng)脈粥樣硬化的治療提供

3、一種新的選擇。目前，人們對(duì)趨化因子及其受體的結(jié)構(gòu)、功能有了較全面的了解，大量研究表明，在AS形成過(guò)程中多種趨化因子及其受體起著重要作用。其主要利用相關(guān)基因缺失的小鼠模型和藥物干預(yù)等方法，研究單個(gè)趨化因子和受體與AS的相關(guān)性，但是仍有很多趨化因子與AS的相關(guān)性未見(jiàn)報(bào)道，其中CCR3、CCR5及其配體在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中所起作用及其分子機(jī)制尚不清楚。
　　ApoE基因缺失(apoE deficient，apoE-/-)小鼠在普通標(biāo)準(zhǔn)

4、飲食條件下能夠自發(fā)產(chǎn)生AS病變，且發(fā)病過(guò)程與人類AS極為相似，是研究人類AS的理想模型。因此，本實(shí)驗(yàn)以高脂飲食飼養(yǎng)的apoE-/-小鼠作為模型，通過(guò)血生化分析、病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)、Real-time PCR和免疫組織化學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，對(duì)小鼠的血脂水平、主動(dòng)脈AS病變情況進(jìn)行分析，并對(duì)CCR3、CCR5及其配體基因在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律進(jìn)行系統(tǒng)的分析，同時(shí)檢測(cè)了CCR5和CCL5在蛋白水平的表達(dá)和分布情況，著重探討了CCR3、CCR

5、5及其配體的表達(dá)與AS病變的關(guān)系，以及其中可能的導(dǎo)致AS病變的機(jī)制，有助于進(jìn)一步闡明該疾病的發(fā)生機(jī)制，為進(jìn)一步開(kāi)展AS的基礎(chǔ)應(yīng)用性研究提供有價(jià)值的理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:
　　1.載脂蛋白E(apoE)是多種血漿脂蛋白的組成部分，脂蛋白通過(guò)apoE配體，與細(xì)胞表面的脂蛋白受體結(jié)合，促進(jìn)脂蛋白進(jìn)入肝細(xì)胞和肝外組織細(xì)胞進(jìn)行分解代謝，在膽固醇等的運(yùn)輸和代謝中發(fā)揮重要作用。由于小鼠中apoE基因缺失，使富含甘油三酯和膽固醇的脂

6、蛋白無(wú)法通過(guò)配體受體結(jié)合的方式進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行代謝，造成血漿中大量脂質(zhì)不能及時(shí)清除而積累，進(jìn)而出現(xiàn)高膽固醇血癥。
　　血生化分析結(jié)果顯示，隨著年齡的增加，apoE-/-小鼠血漿中的總膽固醇(total cholesterol，TC)水平有顯著的變化，甘油三酯(triglyceride，TG)變化并不明顯。高脂高膽固醇飲食處理后，血漿中TC水平顯著升高，4周時(shí)達(dá)到最大值約56 mmol/L，在6周時(shí)開(kāi)始緩慢下降，到飲食處理16周時(shí)，下降

7、到40 mmol/L左右。血漿中TG的變化不明顯，平均值在1.4 mmol/L左右。
　　2.ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部連續(xù)冷凍切片，染色后光鏡下檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，apoE-/-小鼠主動(dòng)脈根部有明顯的陽(yáng)性染色區(qū)，表明主動(dòng)脈根部瓣膜處的動(dòng)脈壁發(fā)生脂質(zhì)沉積，并伴有泡沫細(xì)胞的聚集，且隨年齡的增長(zhǎng)，病變程度逐漸加深。飲食處理16周時(shí)，小鼠主動(dòng)脈根部AS病變區(qū)域增多，病變面積增大，管腔逐漸變小，平滑肌細(xì)胞增殖并遷移，進(jìn)一步吞噬脂質(zhì)，在病變嚴(yán)重的區(qū)

8、域，斑塊內(nèi)部出現(xiàn)膽固醇結(jié)晶以及壞死核心。
　　全長(zhǎng)主動(dòng)脈大體染色結(jié)果顯示，主動(dòng)脈病變部位的油紅O陽(yáng)性染色區(qū)主要分布于主動(dòng)脈弓部、胸主動(dòng)脈分支處和腹主動(dòng)脈分支處，這些部位由于具有血管分支，剪切力較大，更容易發(fā)生脂質(zhì)的沉積并產(chǎn)生病變斑塊。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，小鼠全長(zhǎng)主動(dòng)脈的病變面積逐漸增大。
　　3.本實(shí)驗(yàn)采用Real-time PCR的方法，檢測(cè)了在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中CCR3、CCR5及其多種配體CCL3(MIP-1

9、α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL11(eotaxin)和CCL26(eotaxin-3)mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，結(jié)合于同一種受體的多種配體具有不同的表達(dá)規(guī)律。
　　隨著AS病變程度的發(fā)展，趨化因子受體CCR5的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，高脂飲食處理12周時(shí)達(dá)到最大值，在隨后的14-16周，表達(dá)量有所下降。CCR5配體的檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著病變的加重，趨化因子CCL3、CCL4表達(dá)水平持續(xù)上升，在飲

10、食處理12周時(shí)到達(dá)最大值，然后表達(dá)量開(kāi)始下降。而趨化因子CCL5表現(xiàn)出一種不同的表達(dá)模式，在AS病變的早期，CCL5的表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)，高脂飲食處理4周時(shí)到達(dá)最大值，6周時(shí)表達(dá)量開(kāi)始下降，并一直持續(xù)到14周，16周時(shí)有所回升。從結(jié)果中得出，趨化因子CCL5的表達(dá)水平與AS的病變程度并非平行的關(guān)系，說(shuō)明CCL5可能在AS的病變?cè)缙谄鸬街匾淖饔?，而在病變的晚期階段，CCL5所起到的趨化作用被其他趨化因子或細(xì)胞因子所取代。同時(shí)，趨化因子受

11、體CCR3及其配體的表達(dá)結(jié)果顯示，隨著AS病變的發(fā)展，CCR3表達(dá)水平上升，飲食處理12周時(shí)達(dá)到最大值，14周時(shí)開(kāi)始下降，趨勢(shì)與CCR5相似。其配體CCL11和CCL26的表達(dá)趨勢(shì)卻相差很大，CCL11的表達(dá)趨勢(shì)與CCR3一致，而CCL26在AS病變的早期表達(dá)升高，這種表達(dá)水平的差異可能是由于不同的趨化因子在AS病變過(guò)程中所起的作用和起作用的時(shí)期有所不同，這一點(diǎn)值得我們做進(jìn)一步的研究。
　　4.本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用免疫組織化學(xué)的實(shí)驗(yàn)技

12、術(shù)，檢測(cè)了CCR5和CCL5在AS病變部位的蛋白表達(dá)情況，并利用熒光抗體雙標(biāo)的方法，通過(guò)與AS病變部位不同類型細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白的共定位，進(jìn)一步對(duì)CCR5和CCL5進(jìn)行定性和定位。
　　熒光免疫組化的結(jié)果顯示，在飲食處理0周時(shí)(即小鼠6周齡)，雖然在顯微鏡下看不到AS病變，但CCL5和CCR5在動(dòng)脈壁細(xì)胞中已經(jīng)開(kāi)始表達(dá)，并主要定位于動(dòng)脈壁中膜的平滑肌細(xì)胞當(dāng)中，而內(nèi)皮細(xì)胞幾乎不表達(dá)。飲食處理4周后，CCL5在動(dòng)脈壁以及AS早期病變部位

13、表達(dá)顯著升高，且定位于AS病變部位的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞當(dāng)中，內(nèi)皮細(xì)胞同樣不表達(dá)。在飲食處理12周時(shí)，伴隨著AS病變的進(jìn)一步加重，病變斑塊面積不斷增大，CCR5蛋白表達(dá)量也顯著增加，并且主要定位于AS病變斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞當(dāng)中，內(nèi)皮細(xì)胞中幾乎沒(méi)有表達(dá)。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)揭示了CCR3、CCR5及其配體在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律和可能的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，隨著AS病變的發(fā)展，趨化因子受體CCR3、CCR5及其配

14、體趨化因子CCL3、CCL4和CCL11的表達(dá)均顯著上調(diào)，說(shuō)明這些趨化因子在AS病變部位的高表達(dá)可趨化、募集更多的表達(dá)有相應(yīng)趨化因子受體(如CCR3、CCR5)的炎性細(xì)胞并發(fā)生遷移、浸潤(rùn)，參與AS斑塊的形成，進(jìn)一步加重AS病變的程度。另外，在AS病變?cè)缙?，CCL5和CCL26的表達(dá)顯著升高，說(shuō)明其在AS發(fā)病早期起主要作用。并且，血管壁中膜的平滑肌細(xì)胞是CCL5的主要來(lái)源，CCL5的高表達(dá)可趨化多種炎性細(xì)胞到血管壁，并遷移到病變部位，介導(dǎo)