硫酯酶結(jié)構(gòu)域和酮內(nèi)酯類化合物生物合成之間關(guān)系的研究.pdf

1、紅霉素(erythromycin)C-3位羥基由模塊6中酮還原酶(ketoreductase，KR)決定，因此，通過基因工程的方法敲除或使KR6喪失功能后，C-3位可保持酮基狀態(tài)。利用染色體同源重組技術(shù)已構(gòu)建了一系列糖多孢紅霉菌KR6突變體，均合成酮內(nèi)酯類化合物3-脫氧-3-羰基-6-脫氧-紅霉內(nèi)酯B(3-deoxy-3-oxo-6-deoxy-erythronolideB，DODEB)，并進(jìn)一步被羥基化修飾為3-脫氧-3-羰基-紅霉內(nèi)

2、酯B(3-deoxy-3-oxo-erythronolideB，DOEB)，然而產(chǎn)量比較低。 在聚酮合成酶(polyketidesynthase，PKS)中，硫酯酶(thioesterase，TE)負(fù)責(zé)將聚酮長鏈從PKS上水解下來，并在其它酶域的協(xié)助下環(huán)化為大環(huán)內(nèi)酯環(huán)，因此對聚酮的生物合成非常重要。DODEB的環(huán)化前體β-長鏈酮脂肪酸不是紅霉素TE(EryTE)的天然底物，EryTE對它的催化效率可能會降低。為研究TE酶結(jié)構(gòu)域與

3、酮內(nèi)酯類化合物合成之間的關(guān)系，克隆了EryTE的基因，分別連接到表達(dá)載體pZM和pZMW上構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。PEG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入糖多孢紅霉菌KR6突變體中表達(dá)。以乙酸乙酯萃取發(fā)酵產(chǎn)物，通過薄層層析和枯草桿菌抑菌試驗進(jìn)行產(chǎn)物及活性檢測。結(jié)果顯示EryTE并沒有顯著促進(jìn)酮內(nèi)酯類化合物DODEB的合成。研究指出，載體蛋白(acylcarrierprotein，ACP)與TE結(jié)合在一起更能有效發(fā)揮TE酶結(jié)構(gòu)域的催化活性，因此，又克

4、隆了紅霉素ACP6-TE(EryACP6-TE)的基因并轉(zhuǎn)入KR6突變體表達(dá)，仍舊沒有顯著促進(jìn)DODEB的合成。 C-3位的酮基是影響EryTE活性的最大可能部位，苦霉素(pikromycin)TE催化C-3位為酮基的聚酮鏈底物的能力遠(yuǎn)比EryTE為高。為此，克隆了苦霉素ACP-TE(PikACP-TE)的基因并轉(zhuǎn)入KR6突變體中表達(dá)，結(jié)果也沒有檢測到DODEB合成產(chǎn)量的顯著提高。這揭示了，結(jié)構(gòu)域獨立于聚酮合成酶模塊(modul

5、e，M)時，不能有效發(fā)揮功能，將TE酶結(jié)構(gòu)域融合于模塊中或許可以有效發(fā)揮活性?；谏鲜鲈?，利用染色體同源重組技術(shù)，以苦霉素模塊6中PikACP-TE的基因直接替換糖多孢紅霉菌染色體模塊6中EryKR6-ACP6-TE的基因構(gòu)建了TE酶結(jié)構(gòu)域替換菌株A226-PTE。然而，質(zhì)譜分析A226-PTE的發(fā)酵液時并沒有檢測到DODEB及其修飾物的特征峰。推測雜合模塊中結(jié)構(gòu)域間識別效率降低進(jìn)而造成雜合模塊活性的下降，是沒有檢測到酮內(nèi)酯類化合物的

6、原因之一。 模塊是聚酮鏈合成的最小功能單位，因此，模塊替換可能更為合理。不過，考慮到整個模塊6的替換難度太大，因此，先將苦霉素模塊6(PikM6)的基因轉(zhuǎn)入KR6突變體中表達(dá)。結(jié)果顯示PikM6顯著促進(jìn)酮內(nèi)酯類化合物的合成。表明，以獨立肽鏈形式存在的PikM6在糖多孢紅霉菌中可以充分發(fā)揮聚酮合成酶的功能，這為下一步的模塊替換提供了現(xiàn)實依據(jù)；同時也證實了，TE只有融合于模塊中，在模塊中其它所有結(jié)構(gòu)域協(xié)助下，才可以充分發(fā)揮硫酯酶的功