幾種天然植物成份治療幽門螺桿菌感染的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的： 幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)可引起慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍等上消化道疾病，并與胃癌、胃粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生有關(guān)?，F(xiàn)階段臨床治療Hp感染仍然采用抗生素，但此種治療手段存在患者依順性差、費(fèi)用昂貴、毒副作用強(qiáng)及日趨嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性等問題。天然植物成份可以避免這些弊端，目前已有研究發(fā)現(xiàn)，一些天然植物成份對Hp表現(xiàn)出一定的抗菌效果，包括天然植物成份乳香膠、大蒜油、黃連等。 本

2、研究選用乳香膠和公認(rèn)抗菌譜較廣的大蒜油、黃連提取物及小檗堿作研究對象，對這幾種天然植物成份抗Hp活性進(jìn)行了初步研究，通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)探明其體外抗菌活性及清除Hp的療效，通過耐藥性誘導(dǎo)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究和毒理學(xué)研究探討其耐藥性和安全性，通過藥代動(dòng)力學(xué)研究，確定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為藥物的開發(fā)和評價(jià)提供理論依據(jù)。 方法： 1.天然植物成份體外抗菌活性研究。瓊脂平板二倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)；試管二倍稀釋法測定最低殺菌濃度(

3、MBC)；菌落計(jì)數(shù)法繪制殺菌曲線；探索接種量及培養(yǎng)基pH值對藥物所測MIC的影響；掃描和透射電鏡觀察藥物作用前后細(xì)菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。 2.天然植物成份體內(nèi)抗Hp活性實(shí)驗(yàn)。 (1)乳香膠治療劑量篩選試驗(yàn)。將感染沙鼠180只分為乳香膠藥物劑量組(15mg、7.5mg、3.75mg)、溶劑治療組、未用藥治療組和陽性藥物治療組(奧美拉唑3mg和克拉霉素2mg)，分別對它們連續(xù)用藥治療14d。在用藥治療第8d、停藥后第1d、停藥后

4、第20d宰殺沙鼠，取胃組織分別做尿素酶實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、PCR檢測。觀察清除率。 (2)多種天然植物成份清除率比較試驗(yàn)。將感染沙鼠140只分為15mg乳香膠組、15mg大蒜油組、15mg黃連提取物組、15mg小檗堿組、溶劑治療組、未用藥治療組和陽性藥物治療組(奧美拉唑3mg和克拉霉素2mg)，分別對感染沙鼠連續(xù)用藥治療14d，Hp全菌疫苗在0、1、2、3w肌肉注射免疫沙鼠及其與15mg乳香膠共同治療，在停藥后第1d

5、、停藥后第20d或免疫結(jié)束第14d宰殺沙鼠，取胃組織分別做尿素酶實(shí)驗(yàn)、組織病理學(xué)檢查、分離培養(yǎng)、PCR檢測。觀察清除率。 3.Hp的體外耐藥誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。采用多步誘導(dǎo)法，選用臨床耐藥率很高的抗生素甲硝唑和目前抗Hp療效好的抗生素克拉霉素做對照。在乳香膠、大蒜油、黃連提取物、小檗堿、甲硝唑和克拉霉素濃度逐漸增加的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種Hp，觀察MIC的變化。將敏感性下降的誘導(dǎo)株在無藥培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種3次后，檢測其MIC值。測定乳香膠、乳香膠、大蒜油

6、、黃連提取物和小檗堿對甲硝唑、克拉霉素敏感性下降誘導(dǎo)株的MIC值。 4.以抑菌效應(yīng)法指標(biāo)檢測乳香膠的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。 5.通過急性毒性試驗(yàn)和長期毒性試驗(yàn)對乳香膠進(jìn)行毒理學(xué)研究。按最大耐受劑量法，灌服小鼠，觀察7d內(nèi)小鼠的死亡情況；每天按不同劑量灌服大鼠1次，連續(xù)30天，檢測血液、生化學(xué)指標(biāo)，臟器重量及重量檢測，臟器組織做病理切片。 結(jié)果： 1.四種天然植物成份均表現(xiàn)體外抗菌活性。乳香膠、大蒜油、黃連提取物

7、和小檗堿對HpSS1的MIC值分別為125ug/ml、82.5ug/ml、1000ug/ml和500ug/ml；對金葡球菌ATCC25923的MIC值分別為1000ug/ml、82.5ug/ml、4000ug/ml和2000ug/ml；對大腸桿菌ATCC25922的MIC值分別為2000ug/ml、330ug/ml、8000ug/ml和2000ug/ml。它們對HpSS1的MBC為500ug/ml、165ug/ml、1000ug/ml和

8、500ug/ml；對金葡球菌ATCC25923的MBC值分別為2000ug/ml、330ug/ml、8000ug/ml和4000ug/ml；對大腸桿菌ATCC25922的MBC值分別為8000ug/ml、1320ug/ml、32000ug/ml和8000ug/ml。從殺菌曲線看，三種藥物在濃度為1/2MIC和1/4MIC時(shí)，三個(gè)菌株均比對照菌株增菌緩慢。當(dāng)濃度提高到2MIC和4MIC時(shí)，對Hp，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的殺菌

9、作用，存在明顯的量效關(guān)系。乳香膠的體外抗菌活性可受接種菌量，培養(yǎng)基pH值的影響。當(dāng)接種量增加至109CFU/ml，培養(yǎng)基pH值減小為4.0或增加為9.0時(shí)，乳香膠的抗菌活性減弱。乳香膠作用Hp后，電鏡下可見一些形體變小，胞質(zhì)稀疏的個(gè)體，細(xì)胞壁有破損，胞質(zhì)外溢。 2.天然植物成份體內(nèi)抗Hp活性實(shí)驗(yàn)。(1)用乳香膠治療第8d后，3.75mg劑量組清除是25％，7.5mg劑量組清除率是0％，15mg劑量組清除率是50％，停藥后第1d后

10、，三個(gè)劑量組的清除率都為100％。停藥后第20d后，3.75mg劑量組清除率是25％，7.5mg劑量組清除率是50％，15mg劑量組清除率是100％。陽性性藥物治療組三個(gè)時(shí)間段清除率均為100％。(2)應(yīng)用天然植物成份乳香膠、大蒜油、黃連提取物、小檗堿及Hp全菌疫苗，乳香膠+Hp全菌疫苗對感染沙鼠進(jìn)行清除治療，用藥后第1d后，前四種藥物清除率分別為90％、70％、70％和60％。用藥后第20d后，它們對感染沙鼠的清除率為100％、80％

11、、70％、70％、70％和100％，陽性性藥物治療組兩個(gè)時(shí)間段清除率均為100％。 3.Hp的體外耐藥誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。在體外耐藥誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中，乳香膠、大蒜油、黃連提取物和小檗堿組的MIC值保持不變，即未誘導(dǎo)出對乳香膠、大蒜油、黃連提取物和小檗堿耐藥的Hp菌株，而在含64MIC甲硝唑的培養(yǎng)基上菌株仍能生長。在培養(yǎng)過程中，菌株對甲硝唑的敏感性逐漸下降，MIC值逐漸升高，最后達(dá)到64μg.mL-1。甲硝唑耐藥株(MR)在無藥培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)種1

12、0次后得到MR’，MIC值不變。乳香膠、大蒜油、黃連提取物和小檗堿對MR的MIC沒有影響。 4.乳香膠的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：Ka=0.666h-1，Ke=0.143h-1，t1/2(Ka)=1.041h，tl，2(Ke)=4.856h，Lagtime=0.574h，T(peak)=3.0h，C(max)=0.9503ug/ml，AUC=3.2605ug/ml.h，CL/F=38.03g/kg·h/(ug/ml)，V/F=266.8(g

13、/kg)/(ug/ml)。 5.小鼠7d內(nèi)無死亡，大鼠一般狀況、血象、血液生化學(xué)指標(biāo)、臟器重量及重量指數(shù)檢測未見異常，病理切片無異常改變。 結(jié)論： 1.乳香膠、大蒜油、黃連提取物和小檗堿均有抗幽門螺桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性。 2.乳香膠在體內(nèi)治療Hp感染有效，但停藥后實(shí)驗(yàn)小劑量組有復(fù)發(fā)。15mg劑量組清除率為100％，而且沒有復(fù)發(fā)。15mg乳香膠與相同劑量的大蒜油、黃連提取物、小檗堿及Hp全菌疫

14、苗比較，在體內(nèi)試驗(yàn)中，他們均是有效的，乳香膠組效果最佳。乳香膠與Hp全菌疫苗共同使用，沒有產(chǎn)生相互拮抗的作用。 3.Hp對乳香膠、大蒜油、黃連提取物和小檗堿不易產(chǎn)生耐藥性，甲硝唑誘導(dǎo)出高度耐藥株，且甲硝唑耐藥株對乳香膠、大蒜油、黃連提取物和小檗堿仍保持敏感，乳香膠、大蒜油、黃連提取物和小檗堿是有良好開發(fā)前景的抗Hp感染的天然藥物。 4.乳香膠的藥動(dòng)學(xué)過程符合一室開放模型。該藥灌胃給藥后，吸收較為迅速，而消除則相對較為緩慢