骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)血管性癡呆大鼠行為學(xué)及鈣通道影響的研究.pdf

1、目的: 通過(guò)復(fù)制血管性癡呆（Vascular Dementia, VaD）大鼠模型并對(duì)其進(jìn)行行為學(xué)和鈣通道相關(guān)信號(hào)通路檢測(cè)，探討VaD大鼠鈣通道信號(hào)通路的改變，分析其改變引起記憶認(rèn)知障礙的可能機(jī)制。同時(shí)進(jìn)一步探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）移植對(duì)VaD大鼠認(rèn)知功能的改善和鈣通道以及與鈣通道相關(guān)信號(hào)通路的影響機(jī)制，為BMSCs的臨床應(yīng)用提供適用性資料。
　　方法: （1）通

2、過(guò)貼壁篩選的方法分離、培養(yǎng)BMSCs，至第五代細(xì)胞純化后，用流式細(xì)胞儀對(duì)所培養(yǎng)BMSCs進(jìn)行流式表面抗原鑒定，成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factorbfic，bFGF）和丁羥基茴香醚（Beta Hydroxy Acid，BHA）誘導(dǎo)BMSCs分化為神經(jīng)元細(xì)胞，并對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞，進(jìn)行神經(jīng)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(Neuron speeific enolase，NSE)表達(dá)的免疫組化

3、鑒定。誘導(dǎo)后的BMSCs于移植前24h在其培養(yǎng)液中加入濃度為10μmol/L的標(biāo)記物5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU)，離心收集標(biāo)記后的BMSCs，備用。（2）提前進(jìn)行大鼠水迷宮智力篩查，大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，模型組用改良Pulsinelli’s四血管阻斷法復(fù)制VaD模型，對(duì)照組只分離椎動(dòng)脈和頸總動(dòng)脈，不進(jìn)行椎動(dòng)脈凝閉和頸總動(dòng)脈的夾閉。30天后篩選模型組中認(rèn)知功能障礙的大鼠再分為模型對(duì)照

4、組和干細(xì)胞治療組。干細(xì)胞治療組將誘導(dǎo)后被BrdU標(biāo)記的BMSCs細(xì)胞懸液通過(guò)腦立體定位儀注射到大鼠側(cè)腦室，對(duì)照組和模型對(duì)照組注射等量培養(yǎng)基。細(xì)胞移植30天后進(jìn)行水迷宮行為學(xué)測(cè)試，各組大鼠斷頭取腦，制備石蠟切片，蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）染色觀察大鼠大腦海馬區(qū)病理變化。（3）免疫組化染色方法檢測(cè)移植的細(xì)胞在大鼠腦組織的表達(dá)情況；檢測(cè)血漿和海馬組織一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NO

5、S）活性和NO含量；提取血細(xì)胞和海馬組織總RNA，Real-time PCR方法測(cè)定鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）、鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ（Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseII,CaMKII）和NOS mRNA表達(dá)含量；提取海馬組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量，用蛋白免疫印跡(Western Blotting)法檢測(cè)鈣調(diào)蛋白依賴性激酶（CaMKⅡ）和與鈣通道相關(guān)的NOS蛋白酶

6、的表達(dá)情況。比較對(duì)照組、模型對(duì)照組組和干細(xì)胞治療組中各項(xiàng)指標(biāo)，并對(duì)各組的含量做出差異性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果: （1）通過(guò)貼壁篩選法分離培養(yǎng)BMSCs，體外傳代擴(kuò)增后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)第五代BMSCs表達(dá)粘附分子CD90陽(yáng)性率99.4％，CD29陽(yáng)性率96.8%，CD44陽(yáng)性率99.6%，CD45陽(yáng)性率3.7%。誘導(dǎo)后的BMSCs可表達(dá)NSE和Nestin。（2）模型對(duì)照組組和干細(xì)胞治療組與對(duì)照組相比，模型對(duì)照組組和干細(xì)胞治療組大鼠

7、平均逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于對(duì)照組，撤去平臺(tái)后，模型對(duì)照組和干細(xì)胞治療組第1次穿越平臺(tái)所用時(shí)間延長(zhǎng)，穿越站臺(tái)次數(shù)明顯減少，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。干細(xì)胞治療組較模型對(duì)照組逃避潛伏期縮短（P＜0.05），第1次穿越平臺(tái)時(shí)間縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（3）干細(xì)胞治療組在移植后30天大鼠腦組織雙側(cè)半球切片中可見BrdU染色陽(yáng)性細(xì)胞分布，BrdU陽(yáng)性反應(yīng)物呈棕褐色、顆粒狀或彌漫性分布，位于細(xì)胞核內(nèi)。（4）通過(guò)對(duì)比分析對(duì)照組、模

8、型對(duì)照組和干細(xì)胞治療組與鈣通道及鈣信號(hào)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)差異，結(jié)果顯示模型對(duì)照組上述酶的活性、mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組高（P＜0.05），而干細(xì)胞治療組與模型對(duì)照組相比，CaMKⅡ、CaM、NOS和NO表達(dá)降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論: （1）BMSCs在體外經(jīng)bFGF/BHA誘導(dǎo)可分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，且可表達(dá)Nestin和NSE。（2）VaD模型大鼠與鈣通道主要相關(guān)的NOS和CaMKII信號(hào)表達(dá)增高，提示鈣超載參與到了Va