毛囊定向重建實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　 自體游離毛發(fā)移植術(shù)已成為臨床治療毛發(fā)缺損特別是雄激素性禿發(fā)最常用的手術(shù)方法,但存在許多問(wèn)題,如供區(qū)不足、供區(qū)瘢痕、移植密度低,移植成活率低,明顯影響手術(shù)效果,毛囊組織工程的研究成為了解決這些問(wèn)題的關(guān)鍵。毛囊中各類細(xì)胞的分離是整個(gè)毛囊組織工程研究的基礎(chǔ),毛囊是由上皮成分(包括毛母質(zhì)、內(nèi)外根鞘)和真皮成分(包括毛乳頭、結(jié)締組織鞘)組成的,其中毛乳頭細(xì)胞是構(gòu)成毛乳頭的主要間質(zhì)細(xì)胞,它們是一簇特化的成纖維細(xì)胞。所有的毛

2、乳頭細(xì)胞在外觀上都呈成纖維細(xì)胞樣,而且在含有小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的毛乳頭細(xì)胞有著聚集性生長(zhǎng)的特性。隨著毛囊的周期性循環(huán),毛乳頭的形態(tài)也發(fā)生著周期性的改變。它在毛囊的生長(zhǎng)發(fā)育形成及周期調(diào)控中起著重要的作用。因此建立毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)模型,對(duì)于詳盡地了解毛乳頭細(xì)胞體外培養(yǎng)生長(zhǎng)特點(diǎn),以及如何誘導(dǎo)毛囊的發(fā)生,具有重要的意義。
　　 目的:
　　 (1)研究小鼠皮膚毛囊細(xì)胞的分離方法。
　　 (2)研究表皮細(xì)胞、毛囊細(xì)胞

3、、移植部位對(duì)毛囊重建的影響。
　　 (3)研究可降解支架材料對(duì)毛囊重建的影響。
　　 (4)研究毛囊重建方向的決定因素。
　　 方法:
　　 (1)小鼠皮膚毛囊細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定方法
　　 取3～5d C57BL/6J近交系乳鼠5只,置無(wú)菌培養(yǎng)皿中,安爾碘消毒3遍,PBS充分沖洗,轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中,剪下背部全層皮膚,平鋪于培養(yǎng)皿中,加入0.2％Dispase,充分浸沒(méi)組織塊,置37℃水浴消

4、化2h,倒掉消化液,用鑷子小心提起全層皮膚平鋪于另一干燥的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,真皮面朝上,把真皮從表皮上剝離,表皮行常規(guī)石蠟切片HE染色。PBS沖洗真皮,用剪刀修剪成小塊,取一小塊行常規(guī)石蠟切片H&E染色,其余置離心管中,在37℃緩慢攪拌的條件下加入0.2％Ⅰ型膠原酶消化30分鐘,加入適量完全培養(yǎng)基稀釋消化液,充分振蕩,經(jīng)250μm篩網(wǎng)(60 TYLER MESH)過(guò)濾后收集濾液,150g離5分鐘,收集沉淀重懸于完全培養(yǎng)基,20g離心3分鐘,

5、重復(fù)2次,沉淀再次重懸于適量完全培養(yǎng)基,加等量9％Ficoll。在15ml錐形離心管中加入5ml 9％Ficoll,再緩慢加入10ml上述制備的沉淀-Ficoll混懸液(約含8～10只乳鼠真皮消化物),40g離心5分鐘,去上清液。沉淀重懸于完全培養(yǎng)基,40g離心5分鐘,重復(fù)3次,收集沉淀加入適量0.2％Ⅰ型膠原酶置37℃水浴消化1h,用吸管間斷吹打,消化完畢,加PBS稀釋消化液,450g離心5分鐘,去消化液,再加入0.125％胰蛋白酶3

6、7℃水浴消化10分鐘,加入完全培養(yǎng)基,充分振蕩,經(jīng)25μm篩網(wǎng)(500 TYLER MESH)過(guò)濾后收集濾液,450g離心5分鐘,重復(fù)3次,收集細(xì)胞備用。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)細(xì)胞存活率,行流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD117表達(dá)。
　　 細(xì)胞沉淀重懸于完全培養(yǎng)基,調(diào)整細(xì)胞濃度1×105個(gè)/ml。取1 ml細(xì)胞懸液接種于35mm培養(yǎng)皿(預(yù)先把清潔無(wú)菌的蓋玻片平鋪于皿底),置培養(yǎng)箱1h,去掉培養(yǎng)基,重新加

7、入新鮮培養(yǎng)基置5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h更換一次培養(yǎng)液。細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。小心吸出舊培養(yǎng)液,用PBS清洗(沖洗)3次,加入適量0.125％胰蛋白酶,使消化液的量能蓋住細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞,若多數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)胞質(zhì)回縮,細(xì)胞之間不再連接成片,棄去胰蛋白酶液,加入新鮮的培養(yǎng)液。用吸管將已經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液,置10ml離心管中,500g離心5min,棄上清液,重復(fù)離心洗劑2次,棄去清液,加入2ml培養(yǎng)液,用滴管

8、輕輕吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液,按1:2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)原代培養(yǎng)細(xì)胞及傳代培養(yǎng)細(xì)胞按試劑盒操作說(shuō)明行α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和堿性磷酸酶(ALP)染色鑒定。
　　 (2)毛囊細(xì)胞注射移植方法
　　 取3～5d C57BL/6J近交系乳鼠5只,置無(wú)菌培養(yǎng)皿中,安爾碘消毒3遍,PBS充分沖洗,轉(zhuǎn)移至另一無(wú)菌培養(yǎng)皿中,剪下背部全層皮膚,平鋪于培養(yǎng)皿中,加入0.2％Dispase,充分浸沒(méi)組織塊,置37℃水浴消化2h,倒掉消化

9、液,用鑷子小心提起全層皮膚平鋪于另一干燥的無(wú)菌培養(yǎng)皿中,真皮面朝上,把真皮從表皮上剝離備用。在含表皮的培養(yǎng)皿中加入適量0.125％胰蛋白酶室溫消化10分鐘,用吸管間斷吹打,使表皮細(xì)胞充分游離,加入適量完全培養(yǎng)基。消化液經(jīng)25μm篩網(wǎng)(500 TYLER MESH)過(guò)濾后收集濾液,450g離心5分鐘,重復(fù)3次,收集細(xì)胞備用。
　　 取10mg DiI置離心管中,加入5ml DMSO,避光,37℃水浴,間斷振蕩至充分溶解,無(wú)菌過(guò)濾分

10、裝至PCR反應(yīng)管中,每管10μl,-20℃凍存。調(diào)整表皮細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,取1ml細(xì)胞懸液置離心管中,加入10μl DiI儲(chǔ)存液,吸管吹打混勻。置5％CO2培養(yǎng)箱中標(biāo)記30分鐘。450g離心5分鐘,棄上清,重懸于完全培養(yǎng)基中,重復(fù)上述離心過(guò)程3次以去掉多余的熒光探針。重懸于完全培養(yǎng)基中備用。按同樣濃度對(duì)毛囊細(xì)胞行DiO標(biāo)記。
　　 取表皮細(xì)胞(1×107個(gè))+毛囊細(xì)胞(1×107個(gè))制成1ml細(xì)胞懸液,在裸鼠背部標(biāo)記

11、5個(gè)點(diǎn),用1ml注射器行皮內(nèi)注射,形成一小水泡,按住進(jìn)針點(diǎn)出針。每點(diǎn)注射0.1ml,每點(diǎn)注射細(xì)胞數(shù)目為1×106個(gè)。按同樣注射方法行表皮細(xì)胞(1×106個(gè))、毛囊細(xì)胞(1×106個(gè))、毛囊細(xì)胞(1×105個(gè))、毛囊細(xì)胞(1×104個(gè))、毛囊細(xì)胞(1×103個(gè))、1代培養(yǎng)毛囊細(xì)胞(1×106個(gè))、2代培養(yǎng)毛囊細(xì)胞(1×106個(gè))、3代毛囊細(xì)胞(1×106個(gè))、表皮細(xì)胞(1×106個(gè))+大鼠足底成纖維細(xì)胞(1×106個(gè))注射。3周后取材行冷

12、凍切片熒光檢測(cè)和石蠟切片HE染色。
　　 按上述同樣注射方法,行毛囊細(xì)胞(1×106個(gè))皮內(nèi)注射,分別在在2d、4d、1周、3周、6周后取材行冷凍切片熒光檢測(cè)和石蠟切片HE染色。
　　 毛囊細(xì)胞(1×107個(gè))制成1ml細(xì)胞懸液,在裸鼠背部標(biāo)記5個(gè)點(diǎn),用20ml注射器針頭穿刺至筋膜,用移液器吸取0.1ml細(xì)胞懸液沿穿刺點(diǎn)平行插入皮下,把細(xì)胞注射在筋膜表面,每點(diǎn)注射0.1ml。3周后取材行冷凍切片熒光檢測(cè)和石蠟切片HE染色

13、。
　　 (3)毛囊細(xì)胞與材料的復(fù)合移植方法
　　 把Ⅰ型膠原海綿置無(wú)菌培養(yǎng)皿中,修剪成1×1cm大小。調(diào)整毛囊細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,每塊膠原海綿滴加0.1ml細(xì)胞懸液。取裸鼠3只,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在頭部和尾部分別切開(kāi)長(zhǎng)約1cm切口,深達(dá)筋膜,將膠原海綿置入皮下,縫合切口。4W取材行石蠟切片HE染色。
　　 取PLGA微管,剪成長(zhǎng)

14、1.5cm小段,浸75％酒精消毒1h,PBS沖洗3遍,浸PBS過(guò)夜備用。取裸鼠3只,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在頭部和尾部分別切開(kāi)長(zhǎng)約0.5cm切口,深達(dá)筋膜,將PLGA微管插入皮下。調(diào)整毛囊細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,在每個(gè)微管中注入細(xì)胞懸液0.1ml?？p合切口。4w取材行石蠟切片HE染色。
　　 Ⅰ型膠原海綿、PLGA微管直接裝臺(tái)鍍膜進(jìn)行掃描。毛囊細(xì)胞與Ⅰ型

15、膠原海綿復(fù)合培養(yǎng)1w后,棄培養(yǎng)液,加入PBS清洗3遍,經(jīng)固定、干燥行掃描電鏡檢測(cè)。
　　 (4)毛囊細(xì)胞小室移植方法
　　 毛囊細(xì)胞開(kāi)放小室移植 取5ml耐高溫的塑料離心管,去掉中央部分,在蓋子下端貼一層透明膠帶,固定后在膠帶中央扎數(shù)個(gè)小孔,高壓消毒備用。取5只裸鼠,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在背部切除一加圓形皮膚,深達(dá)筋膜,直徑為離心管蓋直徑的一半。把制

16、備好的離心管蓋子插入皮下,蓋子下端朝向皮膚表面,暴露于空氣中,把皮膚縫合在蓋子周邊固定,形成一個(gè)可以容納細(xì)胞懸液的開(kāi)放小室。調(diào)整毛囊細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,在每個(gè)小室內(nèi)注入細(xì)胞懸液0.1ml。同時(shí)行單獨(dú)小室移植作為對(duì)照組。4w取材行石蠟切片HE染色和冷凍切片熒光檢測(cè)。
　　 毛囊細(xì)胞封閉小室移植 取5ml耐高溫的塑料離心管,去掉中央部分,高壓消毒備用。取5只裸鼠,腹腔注射戊巴比妥鈉0.4ml/100g(10mg/ml),麻

17、醉成功后,安爾碘消毒背皮膚3遍,在背部切開(kāi)全層皮膚,切口長(zhǎng)度為離心管蓋直徑的一半,深達(dá)筋膜,把制備好的離心管蓋子完全插入皮下,使皮膚完全覆蓋整個(gè)蓋子,切口縫合固定,形成一個(gè)可以容納細(xì)胞懸液的皮下封閉小室。調(diào)整毛囊細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml,在每個(gè)小室內(nèi)注入細(xì)胞懸液0.1ml。4w取材行石蠟切片HE染色和冷凍切片熒光檢測(cè)。
　　 結(jié)論
　　 (1)本研究首次采用小鼠皮膚制備了毛囊單細(xì)胞懸液。其細(xì)胞成份主要為毛乳頭細(xì)胞,含

18、有2.5％CD34陽(yáng)性的毛囊干細(xì)胞,8.3％CD117陽(yáng)性的黑色素細(xì)胞。
　　 (2)本研究中所分離的毛囊細(xì)胞裸鼠皮內(nèi)注射能夠重新進(jìn)行發(fā)育,形成大量結(jié)構(gòu)完整的正常毛囊和皮脂腺。這種毛囊的再生依賴于所移植細(xì)胞的密切接觸。
　　 (3)Ⅰ型膠原海綿和PLGA微管不支持毛囊細(xì)胞的定向重建。
　　 (4)毛囊的發(fā)育空間為再生毛囊的定向提供了可能性,而氣液界面則決定了最終新生毛囊的方向。毛囊細(xì)胞開(kāi)放小室移植可以實(shí)現(xiàn)新生毛囊