骨缺損重建的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 臨床上，由于外傷、腫瘤、炎癥或骨吸收引起大面積的骨缺損無法自行修復(fù)和重建，骨移植替代材料常常被用作大型骨缺損的替代體，應(yīng)用于骨缺損的修復(fù)中。理想的骨替代材料需要有良好的生物相容性，對(duì)機(jī)體無毒性，不引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，同時(shí)要有良好的骨傳導(dǎo)性和/或骨誘導(dǎo)性，并且可以在機(jī)體內(nèi)自行降解，最終被宿主新生骨組織所替代。 nHAC/PLA支架材料是一種具有與天然骨相似成分及結(jié)構(gòu)的骨支架材料，本研究中將人成骨細(xì)胞MG-63與其復(fù)合

2、體外培養(yǎng)，以觀察其對(duì)成骨細(xì)胞附著、增殖及生物學(xué)功能的影響，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。 在以往骨組織工程的研究工作中，由于組織工程支架材料多具有三維立體結(jié)構(gòu)，不透光，因此研究者很難使用傳統(tǒng)的手段直觀地觀察細(xì)胞在材料上的生長狀況，給研究細(xì)胞在材料上附著生長的規(guī)律帶來困難。目前尚未有較好的觀察復(fù)合物中細(xì)胞生長的方法?；铙w染料羧基熒光素乙酰乙酸(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl es

3、ter，CFDA-SE)是一種活體熒光染料，研究顯示，CFDASE作為細(xì)胞標(biāo)記物，能穩(wěn)定地存在于細(xì)胞核中且不會(huì)引起細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究應(yīng)用CFDASE標(biāo)記人成骨細(xì)胞，檢測對(duì)細(xì)胞粘附功能的影響，并動(dòng)態(tài)觀察人成骨細(xì)胞在nano-hydroxyapatite/collagen/PolyL-lacticacid(nHAC/PLA)骨支架材料上的粘附生長狀況。 此外，骨組織中的血管再生是骨重塑和生長的重要部分。與骨重塑及骨內(nèi)血管發(fā)生密切相

4、關(guān)的兩種細(xì)胞——成骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，以及二者間的相互作用是相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞合成分泌的血管再生相關(guān)因子，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有誘導(dǎo)血管生成、參與創(chuàng)傷愈合等作用；成骨細(xì)胞表面有內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)受體，它可與血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的ET-1相結(jié)合提高成骨細(xì)胞的功能。本實(shí)驗(yàn)將人成骨細(xì)胞(MG-63)與人臍靜脈血

5、管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVECs)直接共培養(yǎng)，觀察HUVECs對(duì)MG-63功能的影響，為骨組織工程中血管再生研究工作提供依據(jù)。 異體骨植入體內(nèi)后，其生長和代謝狀況受機(jī)體免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，臨床上由于宿主免疫排斥反應(yīng)或慢性炎癥引起的植入骨吸收，壞死等情況經(jīng)常發(fā)生。巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞通過釋放細(xì)胞因子而參與炎癥、免疫反應(yīng)等引起的骨破壞。巨噬細(xì)胞在吞噬了凋亡細(xì)胞以后能夠發(fā)生

6、抗炎性反應(yīng)。磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserinePS)是細(xì)胞凋亡的表面標(biāo)志，巨噬細(xì)胞通過識(shí)別細(xì)胞表面暴露的PS而吞噬凋亡細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)生一系列變化，參與炎癥抑制反應(yīng)。磷脂酰絲氨酸脂質(zhì)體(phosphatidylserineliposomePSL)能夠模擬凋亡細(xì)胞作用而參與免疫調(diào)節(jié)活動(dòng)。因此PSL很有可能通過對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)而參與炎癥性骨破壞的調(diào)節(jié)。因此本研究中，我們通過對(duì)炎癥性骨吸收動(dòng)物模型的研究，檢測PSL對(duì)免疫細(xì)胞及破骨

7、細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，從而揭示PSL對(duì)炎癥性骨破壞的作用，為臨床上由于炎癥、免疫排斥反應(yīng)等引起的骨破壞和吸收的預(yù)防和治療尋找一個(gè)新的思路和方法。 實(shí)驗(yàn)方法： 1、nHAC/PLA支架材料對(duì)MG-63細(xì)胞附著生長及生物學(xué)功能的影響。 將培養(yǎng)的MG-63細(xì)胞接種于nHAC/PLA支架材料上，通過倒置顯微鏡觀察其MG-63細(xì)胞在nHAC/PLA支架材料表面生長情況，并通過對(duì)支架-細(xì)胞復(fù)合體進(jìn)行HE染色等方法對(duì)細(xì)胞在nHAC-

8、PLA架材料上的早期附著生長情況進(jìn)行研究。同時(shí)檢測復(fù)合生長后的MG-63細(xì)胞細(xì)胞增殖指數(shù),ALP活性、RealtimeRT-PCR檢測骨鈣素、I型膠原mRNA的表達(dá)量從而研究nHAC/PLA支架材料對(duì)人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)生物學(xué)功能的影響。 2、CFDASE標(biāo)記觀察人成骨細(xì)胞與骨支架材料附著情況。 用CFDASE標(biāo)記人成骨細(xì)胞，接種于nHAC/PLA骨支架材料上，測定細(xì)胞的粘附率，并用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞在支架材料上的生

9、長狀況。 3、臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)對(duì)人成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響。 取MG-63與人HUVECs直接聯(lián)合共同培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，通過對(duì)人成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性和OC含量測定，觀察HUVECs對(duì)人成骨細(xì)胞功能的影響。 4、PSL對(duì)炎癥性/免疫反應(yīng)性骨吸收的影響。 使用慢性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型，PSL局部給藥，觀察其對(duì)免疫反應(yīng)性骨吸收的影響，并通過檢測炎癥局部組織巨噬細(xì)胞浸潤及相關(guān)炎癥因子釋放情況，探討PSL影

10、響骨吸收的機(jī)理。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、共聚焦顯微鏡及HE染色結(jié)果顯示MG-63細(xì)胞在nHAC/PLA支架材料上生長良好；細(xì)胞增殖指數(shù)比空白對(duì)照組有顯著性提高。在生物學(xué)功能方面，ALP活性、OC及Col-1基因mRNA相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組有也有顯著性提高。 2、CFDASE標(biāo)記的人成骨細(xì)胞的粘附率為(97.99±1.43)％，未標(biāo)記的人成骨細(xì)胞粘附率為(98.57±1.17)％，兩者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

11、 3、人成骨細(xì)胞與HUVECs直接聯(lián)合共培養(yǎng)后，兩種細(xì)胞均生長良好，人成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性和OC定量測定結(jié)果，共培養(yǎng)組明顯高于對(duì)照組。 4、PSL對(duì)關(guān)節(jié)炎有明顯的抑制作用，炎癥組織中，PSL給藥組IL-1β，TNF-α等炎癥促進(jìn)因子的釋放量比對(duì)照組有明顯降低，同時(shí)IL-10等炎癥抑制因子的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。同時(shí)PSL能夠抑制全骨髓細(xì)胞系中破骨細(xì)胞的形成。 結(jié)論： 1、nHAC/PLA支架有利于MG-63細(xì)胞的

12、早期粘附、生長，能夠促進(jìn)人成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能。是一種較好的骨組織工程的支架材料，可以用于骨組織工程研究和治療工作中。 2、熒光活性染料CFDASE標(biāo)記不影響MG-63細(xì)胞在nHAC/PLA骨支架材料上的粘附，可作為觀察人成骨細(xì)胞在nHAC/PLA骨支架材料生長情況的實(shí)驗(yàn)手段。 3、HUVECs在體外與人成骨細(xì)胞直接聯(lián)合共培養(yǎng)中，有明顯促進(jìn)人成骨細(xì)胞活性的作用。 4、PSL能夠通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活動(dòng)，參與抑制炎癥/