人乳頭瘤病毒11型全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠基因元件的設(shè)計(jì)與構(gòu)建.pdf

1、人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）11型是人尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）的主要病原體之一。目前還沒(méi)有根治CA的有效手段，并且對(duì)其致病機(jī)理至今都還不太了解。一種理想的動(dòng)物病理模型對(duì)致病機(jī)理的體內(nèi)研究和治療手段的臨床前評(píng)價(jià)都有重要意義。本課題的內(nèi)容就是設(shè)計(jì)并在質(zhì)粒上構(gòu)建HPV11全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型的外源基因。 HPV11在宿主體內(nèi)表達(dá)出病理蛋白的一個(gè)重要前提是其基因組

2、必須保持游離狀態(tài)，加之該基因?qū)ι掀ぜ?xì)胞的專嗜性，因此HPV11轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的外源基因除了應(yīng)含有HPV11完整基因組外，還要包含能夠在轉(zhuǎn)基因鼠的上皮細(xì)胞，將HPV11切割下來(lái)的基因元件。 本課題首先根據(jù)HPV11的致病特點(diǎn)，結(jié)合成熟的Cre/LoxP可控表達(dá)技術(shù)設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)基因的外源基因及其功能元件。主要思路是將完整開(kāi)放讀碼框的HPV11基因組以3'—5'的順序置于正向連接的兩組LoxP序列中間，LoxP序列兩端分別連接真核細(xì)胞啟動(dòng)子和E

3、GFP序列，當(dāng)出現(xiàn)由上皮細(xì)胞啟動(dòng)子啟動(dòng)的Cre酶表達(dá)時(shí)，可使LoxP中間的HPV11基因組被切下，實(shí)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)游離的自然致病狀態(tài)，同時(shí)LoxP殘基將啟動(dòng)子和EGFP序列相連接，出現(xiàn)熒光。 實(shí)驗(yàn)第一部分為質(zhì)粒構(gòu)建。 本實(shí)驗(yàn)室保存有含HPV11全序列的質(zhì)粒pBR322/HPV11，并獲得了一個(gè)適合于構(gòu)建HPV11兩端功能序列的質(zhì)粒pQE—Trisystem。質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程包括三個(gè)小部分。 第一部分，首先將HPV11全

4、基因組從pBR322/HPV11中切下，同時(shí)酶切質(zhì)粒pQE—Trisystem，并對(duì)回收產(chǎn)物去磷酸化。將回收的HPV11和去磷酸化后的pQE—Trisystem連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a，做菌落PCR實(shí)驗(yàn)以篩選出反向連接陽(yáng)性克隆，得到的產(chǎn)物命名為質(zhì)粒A。 第二部分，首先從質(zhì)粒pIRE2—EGFP中擴(kuò)增出LoxP—EGFP—PolyA序列，擴(kuò)增同時(shí)加上酶切位點(diǎn)，接著對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和質(zhì)粒A進(jìn)行酶切，回收酶切產(chǎn)物。然后將兩個(gè)回收產(chǎn)物相連接

5、，得到的產(chǎn)物命名為質(zhì)粒B。 第三部分，從pBR322/HPV11中擴(kuò)增出LoxP—7931—7072序列，加上酶切位點(diǎn)，酶切PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒B并回收。將兩個(gè)回收產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化DH5a，做菌落PCR實(shí)驗(yàn)以篩選出反向連接陽(yáng)性克隆，得到質(zhì)粒構(gòu)建最終產(chǎn)物，命名為質(zhì)粒C。 實(shí)驗(yàn)第二部分對(duì)構(gòu)建的序列的功能進(jìn)行了初步的體外檢測(cè)。 首先從兒童包皮中分離出人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocytes）。在傳到第二代時(shí)，用脂質(zhì)體法

6、將質(zhì)粒C和表達(dá)Cre酶的質(zhì)粒pIC—Cre共轉(zhuǎn)染角質(zhì)形成細(xì)胞，并設(shè)對(duì)照組，觀察熒光蛋白表達(dá)情況，最后RT—PCR檢測(cè)HPV11早期基因E6的轉(zhuǎn)錄水平。 研究結(jié)果： 1．用核酸凝膠電泳和測(cè)序的方法驗(yàn)證所構(gòu)建的質(zhì)粒C與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的相符。 2．轉(zhuǎn)染入角質(zhì)形成細(xì)胞后實(shí)驗(yàn)組觀察到熒光表達(dá)。 3．RT—PCR檢測(cè)HPV11E6在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)為陽(yáng)性。 4．轉(zhuǎn)染的角質(zhì)形成細(xì)胞和對(duì)照組的角質(zhì)形成細(xì)胞相比，傳代次數(shù)