運(yùn)用芯片技術(shù)對(duì)CMT2L轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行全基因組差異表達(dá)分析.pdf

1、目的:運(yùn)用MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChip(Illumina)芯片，對(duì)pCAGGS-HA-K141NHSPB8轉(zhuǎn)基因小鼠、CAGGS-HA-wtHSPB8轉(zhuǎn)基因小鼠和正常C57BL小鼠的坐骨神經(jīng)組織在不同時(shí)期（3月齡，6月齡和18月齡）的基因表達(dá)進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)其中差異較大的基因，采用熒光定量RT-PCR進(jìn)行mRNA水平的表達(dá)驗(yàn)證，以期明確K141NHSPB8突

2、變?cè)贑MT2L病程不同時(shí)期（發(fā)病前、發(fā)病時(shí)和發(fā)病后期）受調(diào)控基因表達(dá)譜的變化和可能的內(nèi)在分子通路，探討K141NHSPB8突變?cè)贑MT2L的可能發(fā)病機(jī)制。
　　方法:1.pCAGGS-HA-wtHSPB8和pCAGGS-HA-K141N HSPB8的轉(zhuǎn)基因小鼠已經(jīng)在前期工作中構(gòu)建和鑒定成功。以月齡為3個(gè)月（發(fā)病前）、6個(gè)月（發(fā)病時(shí)）、18個(gè)月（病程后期）的pCAGGS-HA-K141NHSPB8轉(zhuǎn)基因小鼠為研究對(duì)象，以月齡匹配的p

3、CAGGS-HA-wtHSPB8轉(zhuǎn)基因小鼠、C57BL小鼠為對(duì)比。
　　2.運(yùn)用全基因組表達(dá)芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)的基因:提取3月齡、6月齡和18月齡pCAGGS-HA-K141NHSPB8，pCAGGS-HA-wtHSPB8的轉(zhuǎn)基因小鼠及C57BL小鼠坐骨神經(jīng)組織mRNA，運(yùn)用MouseRef-8 v2.0 Expression BeadChip(Illumina)芯片分析全基因組的差異表達(dá)。
　　3.運(yùn)用熒光定量RT-PC

4、R驗(yàn)證坐骨神經(jīng)組織基因中差異基因的表達(dá):選取7個(gè)表達(dá)差異明顯的基因和4個(gè)CMT2致病基因，采用熒光定量RT-PCR在3月齡、6月齡和18月齡的pCAGGS-HA-K141NHSPB8轉(zhuǎn)基因小鼠，pCAGGS-HA-wtHSPB8轉(zhuǎn)基因小鼠及C57BL小鼠的坐骨神經(jīng)組織上進(jìn)行上述11個(gè)基因的mRNA水平表達(dá)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:1.通過(guò)基因芯片及生物信息學(xué)分析，我們找出坐骨神經(jīng)差異表達(dá)基因51個(gè)，其中上調(diào)的基因有31個(gè)，下調(diào)的基因有20

5、個(gè)，對(duì)51個(gè)差異基因進(jìn)行蛋白相關(guān)聚類結(jié)果顯示:有8個(gè)基因跟肌肉蛋白相關(guān)（des，myom1，mylpfmyh1，myh4,neb.pvalb, tpm2），6個(gè)基因跟動(dòng)力蛋白結(jié)合有關(guān)（myh1，myh4,neb，nexn，tpm2，xirp2）。通過(guò)功能相關(guān)聚類分析發(fā)現(xiàn)7個(gè)與肌肉收縮相關(guān)的基因（des, myom1，myh1，myh4,pgam2，tcap，trdn），5個(gè)與碳水化合物合成相關(guān)基因（fbp2，pgam2，rbp4，pck

6、1，ppp1r3c），余無(wú)相關(guān)聚合無(wú)特殊意義。
　　2.熒光定量RT-PCR驗(yàn)證坐骨神經(jīng)組織基因中差異基因，選擇表達(dá)水平改變顯著的7個(gè)差異基因fbp2，pgam2，rbp4，pck1，ppp1r3c，myh4，neb）進(jìn)行熒光定量RT-PCR驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)基因芯片分析未發(fā)現(xiàn)CMT2報(bào)道相關(guān)差異基因，挑選出與CMT2相關(guān)的致病基因（mfn2，rab7，nefl，hspb1）共計(jì)11個(gè)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在6月齡和18月齡的

7、K141NHSPB8轉(zhuǎn)基因小鼠中fbp2，pgam2，rbp4，pck1，ppp1r3c表達(dá)上調(diào)，與芯片結(jié)果一致;myh4，neb基因在各年齡段表達(dá)水平無(wú)明顯改變;CMT2致病基因MFN2，RAB7，NEFL，HSPB1在各年齡段表達(dá)水平未見改變。
　　結(jié)論:
　　碳水化合物合成相關(guān)基因(FBP2，PGAM2，RBP4，PCK1，PPP1R3C)表達(dá)水平的改變，及其繼發(fā)的周圍神經(jīng)軸索代謝紊亂和能量代謝異?？赡軈⑴cCMT2L的