miR--34a沉默逆轉靡爛性毒物對角質形成細胞遷移抑制的作用及機制的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　微小RNA(miRNA)是機體一類重要的基因表達調控分子，通過與靶mRNA的3'-UTR區(qū)域不完全配對結合，抑制其轉錄和翻譯，與機體發(fā)育、細胞增殖和分化、DNA損傷修復、凋亡和腫瘤發(fā)生等眾多生物學事件密切相關。miR-34a是p53誘導的miRNA，在DNA損傷應激中發(fā)揮重要作用。芥子氣(sulfur mustard，SM)是皮膚損傷劑，引起皮膚炎癥、紅斑、水皰等病理改變，創(chuàng)面愈合緩慢。目前的研究結果認為芥子

2、氣對DNA的損傷作用是其引起病理變化的分子基礎。我們推測，miR-34a的表達改變可能在SM對皮膚損傷過程中發(fā)揮作用，干預其表達可能會對皮膚的損傷及愈合有影響。因此，本研究中我們用miR-34a的抑制物Ago34a抑制角質形成細胞系HaCaT細胞中miR-34a的表達水平，觀察芥子氣模擬物CEES(2-chloroethyl ethyl sulfide，2—氯乙基乙硫醚)染毒后，角質形成細胞增殖、遷移、粘附、侵襲等指標的改變，以期明確m

3、iR-34a在硫芥損傷的保護作用，并對遷移，粘附，侵襲相關蛋白以及激動蛋白聚合狀態(tài)(F-actin)等進行檢測，以闡明其作用機制。研究結果可為后續(xù)在體研究，如使用miR-34a沉默藥物治療芥類毒物皮膚難愈損傷，提供實驗資料。
　　方法:
　　第一部分 CEES染毒HaCaT細胞miR-34a的變化
　　1.CEES染毒HaCaT細胞模型建立及評價:采用不同CEES劑量(0.2，0.5，1.0，2.0mM)進行染毒，染毒

4、后6h使用MTS法檢測細胞活性，確定后續(xù)試驗染毒的最佳劑量（該劑量對細胞活性有影響，但細胞可以耐受）。采用該劑量在染毒后24h光鏡觀察細胞形態(tài)變化。
　　2.細胞分化標志物檢測:根據上述的毒性實驗結果，確定0.5mM CEES為最佳染毒劑量，使用該劑量染毒24h后，采用基底細胞未分化標志物角質蛋白5(K5)和分化標志物角質蛋白10(K10)對染毒后細胞的分化情況進行檢測，以1.2mM Ca2+誘導分化處理作為陽性對照。
　　

5、3.用stem-loop Q-PCR法檢測成熟miRNA:使用商品化的miRNA檢測用引物，檢測方法與試劑與Q-PCR檢測mRNA類似。在正式的miRNA檢測前，利用溶解曲線評價miRNA檢測引物的質量，同時比較U6和5S作為內參在本染毒模型上的穩(wěn)定性。
　　第二部分 miR-34a沉默對CEES染毒前/后細胞遷移，粘附的影響
　　1.化學合成miRNA轉染實驗:通過轉染效率實驗對轉染方法進行評價。用cy3熒光標記和未標記的

6、miRNA抑制劑轉染細胞，觀察cy3陽性細胞率。miR-34a沉默采用的是商品化的miR-34a沉默(Ago34a)。
　　2.Western blotting:實驗設計為6組，分組如下，miR-34a沉默轉染組(Ago34a)和對照抑制劑轉染(Ago ctr)組，0.5mM CEES染毒miR-34a沉默轉染組，0.5mM CEES染毒對照抑制劑轉染組(Ago34a+0.5)，p38抑制劑干預0.5mM CEES染毒miR-34

7、a沉默轉染組(Ago34a+0.5+P38 inh)，ERK1/2抑制劑干預0.5mM CEES染毒miR-34a沉默轉染組(Ago34a+0.5+ERK1/2 inh)，染毒后24h檢測EGFR，ERK1/2總蛋白，以及p38和ERK1/2磷酸化水平。
　　3.細胞劃痕實驗:實驗分組同上。用于評價各種處理因素下細胞運動遷移的能力。
　　4.細胞粘附實驗:實驗分組同上。用于評價各種處理因素下細胞粘附底物的能力。
　　5

8、.細胞侵襲實驗:實驗分組同上。用于評價各種處理因素下細胞穿透基質膠(Matrixgel)的能力。
　　6.免疫熒光染色F-actin:實驗分組同上。F-actin反映actin的聚合程度，與細胞骨架重塑、遷移、粘附等有關。本實驗用于觀察各種處理因素下細胞內F-actin的分布和熒光強弱。
　　7.流式細胞術分析F-actin:實驗分組同上。用于準確反映各種處理因素下細胞F-actin的平均熒光強度。
　　8.Weste

9、rn Blotting:實驗分組同上。主要檢測各種處理因素下與遷移相關的蛋白（miR-34a的靶蛋白或非靶蛋白）的改變。
　　9.生物信息學分析:與遷移相關的蛋白HDAC6，在miR-34a沉默后增加。使用TargetScan預測和Vector NTI手工比對，預測HDAC63'-UTR的可能miR-34a結合位點。
　　第三部分 miR-34a沉默促CEES染毒細胞遷移的其它因素
　　1.流式細胞術檢測胞膜蛋白Int

10、egrinβ1:實驗分組同前。檢測了和細胞粘附，遷移相關Integrinβ1可能和細胞黏附，遷移相關。
　　2.流式細胞術檢測細胞內Ca2+含量:實驗分組同前。檢測了和Integrinβ1改變相關的Ca2+含量。
　　3.HPLC能量代謝檢測:實驗分組同上。檢測了可能和細胞遷移相關的能量代謝的變化。
　　4.Western Blotting檢測COX-10:實驗分組同上。結果反映能量代謝中氧化磷酸化功能酶的含量變化。<

11、br>　　結果:
　　1.在本實驗室建立了CEES體外染毒模型，發(fā)現0.5 mM CEES是最佳染毒劑量。該劑量下染毒HaCaT可以觀察到細胞粘附、遷移和侵襲能力均降低。部分功能和結構蛋白如K5、iNOS、MMP-1、Fra-1降低顯著，Integrinβ1略有增加。
　　2.0.5 mM CEES染毒可以顯著降低HaCaT細胞K5(基底細胞marker)。但形態(tài)學和K10的WB結果表明，并未有明顯的細胞分化跡象。
　

12、　3.建立了穩(wěn)定的stem-loop Q-PCR法檢測成熟miRNANA，比較了U6和5S兩個內參的穩(wěn)定性（后者更佳），以此法檢測了miR-34a在CEES染毒HaCaT細胞內隨時間后劑量變化后的表達，發(fā)現miR-34a在0.2，0.5mM CEES染毒后12h-24h表達增加，至24h增加3倍左右，該調控是通過該細胞的突變p53來實現的。
　　4.建立了高轉染效率的miRNA轉染方法。miR-34a沉默可以增加細胞遷移和粘附能力

13、。同樣，miR-34a沉默使0.5 mM CEES染毒細胞遷移增加，該遷移能力的變化可以被p38和ERK1/2信號通路抑制劑所降低。miR-34a沉默并未使0.5 mM CEES染毒細胞粘附增加。
　　5.miR-34a沉默引起0.5 mM CEES染毒后一些遷移相關靶蛋白及信號通路激酶磷酸化增加，如c-myc、c-Met、ARHGAP1、HDAC6，以及p38和ERK1/2的磷酸化。遷移相關的信號蛋白iNOS增加依賴于ERK1/

14、2通路激活。Fra-1作為已報道的miR-34a靶蛋白未見增加。
　　6.miR-34a沉默并未顯著改變0.5 mM CEES染毒細胞MMP-1，Integrinβ1，Ca2+含量和能量代謝水平。
　　7.miR-34a沉默顯著增加染毒前/后遷miR-34a沉默引起0.5 mM CEES染毒細胞的ERK1/2信號通路激活，經過ERK1/2抑制劑處理后，細胞出現明顯的分化狀態(tài)。伴隨著胞內Ca2+濃度和Integrinβ1的明顯

15、增加。
　　結論及展望:
　　miR-34a沉默可以顯著增加遷移，并可以部分逆轉CEES染毒引起的細胞遷移降低。miR-34a沉默后引起染毒細胞遷移增強的作用機制可能是:(1) p-p38和p-ERK1/2信號通路的激活;(2)c-Met蛋白表達增強，促使該通路的激活;(3)miR-34a靶蛋白ARHGAP1增加，可能引起下游遷移相關蛋白Rho GTPase增加;(4)HDAC6蛋白增加可能使骨架蛋白和組蛋白去乙?；?。