溫?zé)釋?duì)角質(zhì)形成細(xì)胞熱休克蛋白的影響.pdf

1、目的：
　　本研究擬回答以下問題:角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)過44℃溫?zé)崽幚砗螅欠癞a(chǎn)生特異性高表達(dá)的HSPs?特異性增高的HSPs又能引起哪些分子的改變？溫?zé)嵊绊懴?，這些變化的分子通過何種途徑作用于角質(zhì)形成細(xì)胞？
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)對(duì)象
　　細(xì)胞系選擇為人角質(zhì)形成細(xì)胞系(HaCaT)，購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。受試者為2013年1月至2014年6月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科門診診斷為跖疣的患者，符合臨床

2、診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)本人或其監(jiān)護(hù)人知情同意，入組衛(wèi)生公益性行業(yè)研究專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201202013)項(xiàng)目，自愿接受溫?zé)嶂委?。獲得中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并符合赫爾辛基宣言。
　　二、溫?zé)崽幚矸桨?br>　　1、儀器
　　采用紅外溫?zé)醿x（專利號(hào):ZL200720185403.3，中國醫(yī)科大學(xué)），光源為鎢鹵素?zé)?90％以上的波長(zhǎng)為760-2300nm，波峰為1200nm)，采取非接觸式定點(diǎn)加熱，通過紅外體溫監(jiān)測(cè)儀實(shí)時(shí)反饋體

3、表溫度，使溫度恒定。
　　2、細(xì)胞溫?zé)?br>　　采用水浴加熱的方式溫?zé)?0分鐘，37℃為對(duì)照組，44℃為實(shí)驗(yàn)組。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要收集溫?zé)岷蟛煌瑫r(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞。
　　3、在體溫?zé)?br>　　選取靶皮損進(jìn)行局部溫?zé)嶂委?。第一階段治療為連續(xù)3天，每天30分鐘，溫度為44℃。10天后進(jìn)行第二階段治療，連續(xù)2天，每天30分鐘，溫度為44℃。隨訪觀察6個(gè)月，觀察治療效果。
　　三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)溫?zé)岷驢SPs的時(shí)相性變化

4、>　　分別收集對(duì)照組(37℃)和實(shí)驗(yàn)組(44℃)溫?zé)崽幚砬凹皽責(zé)岷笈囵B(yǎng)1h、2h、4h、12h的HaCaT細(xì)胞，用Qiagen公司的miRNeasy Mini Kit試劑盒提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以HSPA6（HSP70家族成員）、HSP90為引物行real-time PCR檢測(cè)。
　　四、PCR Array方法篩選溫?zé)嵯嚓P(guān)的特異生HSPs
　　收集44℃溫?zé)崽幚砬?，及溫?zé)岷笈囵B(yǎng)2小時(shí)的HaCaT細(xì)胞，提取RNA，逆

5、轉(zhuǎn)錄后行PCR Array檢測(cè)，篩選出特異性表達(dá)的HSPs。
　　五、利用CRISPR/Cas9技術(shù)、慢病毒為載體建立DNAJA4基因敲除細(xì)胞
　　采用CRISPR/Cas9技術(shù)、慢病毒為載體分別轉(zhuǎn)入Cas9及gRNA基因，利用流式細(xì)胞術(shù)、熒光顯微鏡觀察、基因測(cè)序、western blot的方法對(duì)建立的可穩(wěn)定傳代細(xì)胞進(jìn)行驗(yàn)證。
　　六、基因表達(dá)譜差異分析方法探討DNAJA4基因敲除后引起的相關(guān)分子的變化
　　分別

6、收集溫?zé)崽幚砬凹皽責(zé)岷笈囵B(yǎng)2h、18h及36h的空載體及基因敲除細(xì)胞送檢，利用表達(dá)譜差異分析的方法尋找變化的基因，通過相關(guān)通路的對(duì)比分析，尋找與DNAJA4關(guān)系密切的基因，并用real-time PCR的方法驗(yàn)證相關(guān)基因的變化。
　　七、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNAJA4基因?qū)?xì)胞周期的影響
　　收集37℃培養(yǎng)的HaCaT、空載體及基因敲除細(xì)胞，及溫?zé)岷笈囵B(yǎng)36h的空載體及基因敲除細(xì)胞，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，分別比較G0/G1

7、期、S期、G2/M期的百分比。
　　八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　利用GraphPad Prism5軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及圖表的繪制，組間比較用t檢驗(yàn)及方差分析，p＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　一、溫?zé)岣深A(yù)下角質(zhì)形成細(xì)胞差異表達(dá)的熱休克蛋白及其時(shí)相性變化
　　1、44℃溫?zé)崽幚砗?，HSPA6、HSP90在mRNA水平迅速升高
　　角質(zhì)形成細(xì)胞經(jīng)溫?zé)崽幚砗?，HSPA6、HSP90的表達(dá)量

8、逐漸升高。與溫?zé)岷蠹纯滔啾?，HSPA6從2小時(shí)起開始出現(xiàn)差異性高表達(dá)，4小時(shí)后表達(dá)量達(dá)到最高并開始降低;HSP90在4小時(shí)出現(xiàn)差異性高表達(dá)，隨后達(dá)到最高并開始降低。
　　2、通過PCR Array的方法發(fā)現(xiàn)8個(gè)HSPs出現(xiàn)差異性高表達(dá)
　　從80余種熱休克蛋白中篩選發(fā)現(xiàn):溫?zé)岷?，DNAJA4、DNAJB1、CRYAB、BAG3、HSPA6、HSPA1A、HSPA1B及HSPA1L在角質(zhì)形成細(xì)胞中發(fā)生8倍以上的高表達(dá);12個(gè)基

9、因出現(xiàn)2-6倍的上調(diào);余下基因的變化在0.5-2倍之間。
　　3、溫?zé)崾菇琴|(zhì)形成細(xì)胞的DNAJA4在蛋白水平上表達(dá)增高
　　溫?zé)岷?小時(shí)，HaCaT細(xì)胞系中DNAJA4基因在蛋白水平上表達(dá)開始增高。
　　二、構(gòu)建DNAJA4基因敲除角質(zhì)形成細(xì)胞
　　以慢病毒為載體，分別轉(zhuǎn)入Cas9及gRNA基因，經(jīng)多種方法驗(yàn)證:熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞術(shù)顯示90％以上慢病毒載體成功轉(zhuǎn)入HaCaT細(xì)胞中;并且在基因及蛋白水平上成功

10、敲除DNAJA4基因。
　　三、DNAJA4基因影響角質(zhì)形成細(xì)胞中NF-κB通路的IL-1β途徑多個(gè)分子表達(dá)水平
　　1、基因表達(dá)譜差異分析結(jié)果
　　基因表達(dá)譜差異分析方法共鑒定22017種基因，溫?zé)岷笈囵B(yǎng)2小時(shí)及18小時(shí)的細(xì)胞中，DNAJA4的敲除分別僅引起7個(gè)及10個(gè)基因發(fā)生差異性變化;培養(yǎng)36小時(shí)的細(xì)胞中，DNAJA4的敲除可引起50個(gè)基因表達(dá)下降，45個(gè)基因表達(dá)增高。經(jīng)生物信息學(xué)分析提示，IL-1β參與其中多條

11、通路，與感染性疾病密切相關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。
　　2、DNAJA4基因敲除后，NF-κB通路中多個(gè)基因表達(dá)降低
　　對(duì)比溫?zé)崽幚?6小時(shí)后空載體及基因敲除細(xì)胞發(fā)現(xiàn): DNAJA4基因敲除后，IL-1β、IL-1R1、IRAK1、NFKBIA、P50及P65在RNA水平均表達(dá)下降，降低幅度為0.3-0.5倍;P65的S276位點(diǎn)磷酸化蛋白表達(dá)下降。
　　3、DNAJA4基因敲除后，細(xì)胞周期中G1期比例降低，G2/M期

12、比例增高
　　對(duì)比溫?zé)崽幚砗笈囵B(yǎng)36小時(shí)的空載體及基因敲除細(xì)胞發(fā)現(xiàn):DNAJA4基因敲除后，DNAJA4基因敲除細(xì)胞的S、G2期比率升高約5個(gè)百分點(diǎn)。
　　結(jié)論：
　　1、溫?zé)崽幚斫琴|(zhì)形成細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞后，DNAJA4、HSPA6及HSP90等8個(gè)熱休克蛋白發(fā)生8倍以上的高表達(dá);12個(gè)基因出現(xiàn)2-6倍的上調(diào)，其余熱休克蛋白未發(fā)生顯著性變化。
　　2、DNAJA4基因敲除后，NF-κB通路的IL-1β途徑中多