miR-22在舌癌細(xì)胞對平陽霉素藥物敏感性中的作用及分子機制.pdf

1、背景與目的:化療在舌癌的綜合治療中具有十分重要的作用,然而腫瘤的化療耐受一直困擾著化療的有效性,目前舌癌化療耐受的機制仍遠(yuǎn)未完全闡明。microRNA(miRNA)作為轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)者,不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展,而且在腫瘤化療耐受中具有重要的作用。目前尚未有miRNA介導(dǎo)舌癌平陽霉素(PYM)耐藥的報道。本課題擬在首次篩選舌癌PYM耐藥相關(guān)miRNAs的基礎(chǔ)上,探討以miRNA為中心的信號通路,鑒定新的預(yù)測舌癌化療敏感性的生物學(xué)指標(biāo),

2、為預(yù)防或逆轉(zhuǎn)舌癌化療耐藥,提高化療效果提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 (1)運用miRNA芯片miRCURYTM LNA Array(v13.0)比較舌癌親本細(xì)胞Tca8113和耐藥細(xì)胞Tca8113/PYM中的差異miRNA表達(dá)譜,利用miRNA特異實時熒光定量PCR對部分差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行驗證,進(jìn)一步確定舌癌耐藥相關(guān)的miRNA。
　　 (2)選取熒光定量PCR驗證中表達(dá)差異最明顯的miR-22進(jìn)一

3、步進(jìn)行研究;將miR-22真核表達(dá)載體,用脂質(zhì)體分別轉(zhuǎn)染親本細(xì)胞及耐藥細(xì)胞,建立過表達(dá)miR-22的穩(wěn)定細(xì)胞系,同時用miR-22特異性抑制劑anti-miR-22(特異性反義寡核苷酸片段)處理親本及耐藥細(xì)胞系,MTS實驗檢測各處理組細(xì)胞對PYM的敏感性;平板克隆形成實驗檢測過表達(dá)miR-22細(xì)胞組的集落形成能力。
　　 (3)通過生物信息學(xué)軟件對miR-22可能調(diào)控的靶基因進(jìn)行預(yù)測,結(jié)合其生物學(xué)功能和我們前期cDNA芯片結(jié)果,

4、篩選出miR-22可能的靶基因MYST4;RT-PCR和Western blot檢測miR-22表達(dá)載體和anti-miR-22轉(zhuǎn)染前后MYST4的表達(dá)改變,將MYST4mRNA的3’UTR包括miR-22結(jié)合位點、上下游部分側(cè)翼序列以及酶切位點在內(nèi)的共60bp克隆入pMIR-REPORT熒光素酶報告基因載體,將其與β-gal表達(dá)質(zhì)粒及miR-22表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,24h后檢測報告基因的活性。通過反義寡核苷酸片段沉默MYST4

5、的表達(dá)后,MTS實驗檢測Tca8113對PYM的敏感性。
　　 (4)Western blot檢測舌癌Tca8113和Tca8113/PYM中PI3K/Akt信號通路的活性,運用PI3K特異抑制劑LY294004處理Tca8113/PYM后,實時熒光定量PCR檢測miR-22的表達(dá)水平,MTS實驗檢測LY294004處理組細(xì)胞及其對照組對PYM的敏感性。Western blot檢測miR-22及MYST4表達(dá)對PI3K/Akt活

6、性的影響。
　　 (5)實時熒光定量PCR檢測PYM作用Oh,24h,36h后Tca8113中miR-22的表達(dá),同時western blot檢測相關(guān)分子的改變。
　　 結(jié)果:
　　 (1)miRNA芯片結(jié)果顯示,與Tca8113比較,Tca8113/PYM中共篩選出65個差異表達(dá)的miRNA,其中上調(diào)的有41個,下調(diào)的有24個,實時熒光定量PCR驗證結(jié)果顯示miRNA差異表達(dá)趨勢與芯片結(jié)果一致。
　　

7、(2)miR-22過表達(dá)能增加Tca8113對PYM的敏感性并抑制其克隆形成能力,而對Tca8113/PYM則無明顯影響;miR-22被抑制后兩種細(xì)胞對PYM的耐受性均明顯增強。
　　 (3)miR-22能直接下調(diào)MYST4的mRNA及蛋白表達(dá)水平;沉默MYST4的表達(dá)能增加Tca8113對PYM的敏感性。
　　 (4)Tca8113/PYM中PI3K/Akt活性明顯高于Tca8113;LY294004(PI3K特異性抑

8、制劑)以劑量依賴性下調(diào)Akt活性及miR-22的表達(dá),增加Tca8113/PYM對PYM的敏感性;而且,LY294004與miR-22能協(xié)同增加Tca8113/PYM對PYM的敏感性,MYST4表達(dá)沉默能下調(diào)Tca8113細(xì)胞中PI3K/Akt的活性。(5)PYM短期作用能上調(diào)miR-22的表達(dá),而下調(diào)PI3K/Akt的活性以及MYST4的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 (1)首次構(gòu)建了舌癌PYM耐藥相關(guān)的miRNA表達(dá)譜。

9、
　　 (2)miR-22直接通過降解MYST4的mRNA抑制其表達(dá)進(jìn)而增加舌癌細(xì)胞對PYM的敏感性。
　　 (3)PI3K/Akt信號通路與miR-22之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié),miR-22與LY294004協(xié)同增加PYM的抗癌效果。
　　 (4)miR-22,MYST4與PI3K/Akt共同參與PYM對原發(fā)舌癌的抗癌活性,原發(fā)性舌癌中可能存在PYM對miR-22的PI3K/Akt非依賴性調(diào)控,而耐藥細(xì)胞中的PI3K