志賀菌主動外排泵acrAB-to1C及調控基因marOR突變與耐藥的關系.pdf

1、隨著抗生素的應用,志賀菌耐藥現象日益普遍,給細菌性痢疾的防治工作帶來了一定困難。研究表明細菌的耐藥機制涉及多個方面,其中主動外排泵可能起著較重要的作用。本課題組的前期研究已證實志賀菌中也存在AcrAB-Tolc主動外排泵及其調控基因marOR。在對acrAB-tolc泵基因的研究中,發(fā)現耐多藥株的acrA mRNA水平明顯高于敏感株,但acrAB-tolC基因突變株與未突變株中,其mRNA水平的差異無統(tǒng)計學意義；在對調控基因marOR的

2、研究中發(fā)現,該基因第1376-1379位點有4個堿基的缺失存在于志賀菌耐多藥菌株中而不存在于敏感株和參考株中,從而推測該基因突變可能引起外排泵表達水平增高,進而影響志賀菌的耐藥性。
　　 目的
　　 在前期研究的基礎上,本課題旨在研究志賀菌marOR、acrA、acrB和tolC基因的突變情況,調控基因marOR的突變對AcrAB-Tolc主動外排泵表達的影響及其與細菌耐藥的關系。
　　 方法：
　　 1

3、.菌株鑒定:在LB平板上劃線復蘇志賀菌菌株并重新進行血清學及生化鑒定。
　　 2.藥物敏感試驗:采用Kinby-Bauer紙片瓊脂擴散法,質控菌為ATCC25922。
　　 3.有機溶劑耐受試驗:能夠在正己烷與環(huán)己烷比例為3:1的混合溶液中生長的菌株視為有機溶劑耐受菌株。
　　 4.志賀菌marOR、acrA、acrB和tolC基因單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析:PCR擴增marOR、acrA、acrB和

4、tolC基因,并進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,硝酸銀染色,觀察其單鏈構象多態(tài)性并照相。
　　 5.核酸序列分析:根據SSCP分析結果,選擇11株突變株和1株敏感株、1株參考株進行marOR基因測序。
　　 6.志賀菌acrAB-tolC基因轉錄水平分析:利用TRIzol提取志賀菌的總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明書進行第一鏈合成,PCR擴增目的片斷,利用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測marOR突變組與未突變組中acrAB-tolC相對含量

5、。
　　 7.志賀菌株4個堿基缺失的marOR基因克隆及4個堿基缺失聯合3個點突變的marOR基因克隆:利用重疊延伸PCR擴增4個堿基缺失的marOR基因,與T載體連接后轉入DH5a,得到4個堿基缺失的克隆株；4個堿基缺失聯合3個點突變的克隆株是直接擴增具有該突變菌株的marOR基因然后與T載體連接后轉入DH5a所得。最后進行核酸序列分析進行證實。
　　 8.marOR基因不同突變對細菌耐藥性的影響:檢測DH5a、轉入T

6、載體后的DH5a、完整marOR基因的DH5a克隆株、4個堿基缺失的DH5a克隆株及4個堿基缺失聯合3個點突變的DH5a克隆株對多種抗生素的耐藥性,并進行比較。
　　 結果：
　　 1.志賀菌菌株耐藥性檢測:159株志賀菌臨床分離株對TE、C、AM、GM、NOR和SMZ-TMP等6種藥物的藥敏試驗結果,敏感株4株,耐單藥株18株,耐多藥株137株,耐多藥率為86.2％。
　　 2.有機溶劑耐受試驗:159株志賀菌

7、中有122株對有機溶劑耐受,耐受率為76.7％。耐單藥株的有機溶劑耐受率為83.3％,耐多藥株的有機溶劑耐受率為75.9％。
　　 3.志賀菌marOR、acrA、acrB和tolC基因單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析:在159株志賀菌臨床分離株中,4株敏感株未發(fā)現marOR、acrA、acrB和tolC基因突變；155株耐藥株中,marOR基因的突變率為17.4％；acrA基因的突變率為5.8％；acrB基因的突變率為3

8、.9％；tolC基因的突變率為2.6％。
　　 4.核酸序列分析:對參考株、敏感株(Z10)和11株marOR基因突變株的測序發(fā)現,與敏感株和參考株比較,8株突變株均存在1376-1379位點的4個堿基(CATT)缺失和3處點突變；另外3株耐藥菌株中,菌株200011存在1381-1384位點的4個堿基(ATTT)缺失和包括以上3處點突變的多處點突變(與敏感株的匹配度僅有86％),菌株Z23存在5處點突變,菌株Z24存在2處點突

9、變。
　　 5.志賀菌acrAB-tolC基因轉錄水平分析結果:凝膠成像分析表明,突變組acrA、acrB、tolC表達的相對含量明顯高于未突變組acrA、acrB、tolC的相對含量,P<0.05,差異有統(tǒng)計學意義。
　　 6.marOR突變基因克隆:經過PCR擴增、基因克隆和核酸測序證實,已成功獲得空載體克隆、無突變marOR基因、4個堿基缺失突變marOR基因及4個堿基缺失聯合3個點突變marOR基因的克隆,分別記

10、為DH5a(T)、DH5a(marOR),DH5a(marOR-ACTT)、DH5a(marOR-ACTT+3m)。
　　 7.marOR突變對細菌耐藥性的影響:按抑菌環(huán)直徑相差5mm以上為抗生素耐藥性有差別:與DH5a(T)比較,DH5a(marOR-ACTT)對鏈霉素、妥布霉素、先鋒V、頭孢氨芐的耐藥性增加,DH5a(marOR-ACTT+3m)對鏈霉素和四環(huán)素的耐藥性增加；與DH5a(marOR)比較,DH5a(marOR

11、-ACTT)和DH5a(marOR-ACTT+3m)對鏈霉素、四環(huán)素、氯霉素、先鋒V、左氟沙星、環(huán)丙沙星和氟哌酸的耐藥性增加；DH5a(marOR-CATT)與DH5aT(marOR-CATT+3m)相比對除甲氧芐啶外的實驗所用抗生素的抑菌環(huán)直徑無明顯差異。
　　 結論：
　　 1.在志賀菌耐藥菌株中,marOR基因的突變率較高。在檢測的11株志賀菌耐多藥菌株中,8株marOR基因第1376-1379處有4個堿基的缺失和