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文檔簡(jiǎn)介
1、背景及目的:
幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)屬于革蘭氏陰性菌,目前世界上有數(shù)十億人感染了H.pylori,它是公認(rèn)的人類(lèi)慢性胃炎及消化性潰瘍的致病原,與胃粘膜相關(guān)淋巴組織(MALT)淋巴瘤及胃癌密切相關(guān)。H.pylori在人群中的感染非常普遍,并且必須依靠抗生素的使用才能將其根除,否則感染將持續(xù)終生,但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用,H.pylori的耐藥情況日趨嚴(yán)重,并且出現(xiàn)了同時(shí)對(duì)三種或三種以
2、上抗生素耐藥的多重耐藥菌株(multidrug resistant.MDR),如何克服H.pylori的耐藥,提高其根除率已成為一世界性難題。近年研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌外排泵系統(tǒng)在H.pylori耐藥尤其多重耐藥性中起重要作用,與細(xì)菌多重抗生素耐藥性有關(guān)的主動(dòng)外排泵系統(tǒng)主要有5個(gè)家族,其中的RND類(lèi)中AcrAB-TolC外排泵是革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥最主要的占優(yōu)勢(shì)的外排系統(tǒng),是許多革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生耐藥尤其是多重耐藥的主要機(jī)制。
為
3、了探討AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐藥中的作用,本文觀察了臨床分離的 H.pylori MDR菌株和對(duì)常用的9種抗生素全敏感 H.pylori菌株AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因mRNA的表達(dá)差異,并觀察了了H.pylori MDR菌株其相對(duì)應(yīng)的抗生素耐藥基因的突變,同時(shí)研究了幾種常見(jiàn)的外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR株耐藥性的影響,力圖闡明AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐藥中的作用
4、。
方法:
1、H.pylori菌株的選擇:在本實(shí)驗(yàn)室保存的653株H.pylori臨床分離株中篩選出10株對(duì)3類(lèi)/3類(lèi)以上抗生素耐藥的MDR株(耐藥組)和10株對(duì)9種常用抗生素全敏感株(敏感組)。通過(guò)E-test法和K-B紙片擴(kuò)散法重新確認(rèn)和驗(yàn)證這20株H.pylori對(duì)抗生素的敏感性。
2、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因mRNA的檢測(cè):采用q-PCR方法,以gyrB作為參比基因,檢測(cè)兩組細(xì)菌
5、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因hefA、hefB、hefC、hefD、hefE、hefF、hefG、hefH、hefI、HP1489、HP1488 mRNA的相對(duì)表達(dá)量,重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次,并利用SPSS17.0軟件將上述基因的表達(dá)量與5種H.pylori易產(chǎn)生耐藥的抗生素對(duì)應(yīng)的MIC進(jìn)行線性相關(guān)性分析。
3、克拉霉素、左氧氟沙星和甲硝唑特異性耐藥基因的檢測(cè):依據(jù)目前公認(rèn)的耐藥相關(guān)基因?qū)DR株進(jìn)行基因檢測(cè),克拉霉素檢測(cè)
6、23S rRNA;甲硝唑檢測(cè)rdxA和frxA;左氧氟沙星檢測(cè)gyrA。對(duì)耐藥菌株相關(guān)基因行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行DNA測(cè)序分析。步驟如下:①提取H.pylori基因組DNA;②查GeneBank得23SrRNA、rdxA、frxA、gyrA基因,利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。以上面提取的染色體DNA為模版進(jìn)行PCR;③DNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析:PCR產(chǎn)物測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果利用primer Premier5及Ali
7、gnX軟件等生物信息學(xué)軟件,以H.pylori標(biāo)準(zhǔn)株J99為參照,進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
4、外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR株對(duì)抗生素敏感影響的分析:分別在Muller-Hinton培養(yǎng)基中加入以下各種不同作用機(jī)制的外排泵抑制劑:底物競(jìng)爭(zhēng)性抑制PaβN(20mg/L),質(zhì)子動(dòng)力解偶聯(lián)劑CCCP(10mg/L),質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑(10mg/L)、泮托拉唑(10mg/L)、蘭索拉唑(10mg/L)、埃索美拉唑(10mg/
8、L)及雷貝拉唑(10mg/L),然后行藥敏試驗(yàn),觀察外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR菌株菌株MIC的影響。以加入泵抑制劑后抗生素MIC下降≥4倍為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn),認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
結(jié)果:
1、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá):AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因在所有敏感菌株中均未見(jiàn)高表達(dá),而MDR株中有7株存在部分基因高表達(dá)的情況,所有基因的表達(dá)量在兩組間無(wú)明顯差異(P>0.05)。具體結(jié)果
9、:①hefA mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.96±0.71和3.35±9.25,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組中R3菌株表達(dá)量高于29,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3;②hefB mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.13±0.73和4.20±7.22,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組R3及R5菌株表達(dá)量均高于10,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3;③hefC mRNA的相對(duì)表達(dá)量
10、在敏感組和耐藥組分別為1.41±0.93和5.73±13.64,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組R3菌株表達(dá)量高于44,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于4;④hefD mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.86±0.85和3.83±7.30,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組R1、R9菌株表達(dá)量均高于15,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3;⑤hefE mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.56±1
11、.14和9.73±8.79,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組R1、R3及R9菌株表達(dá)量均高于16,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于4;⑥hefF mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.76±0.68和5.30±9.42,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組R9、R10菌株表達(dá)量均高于22,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于4;⑦h(yuǎn)efG mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為0.78±0.48和6.61±1
12、3.84,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組R3、R8及R10菌株表達(dá)量均高于6,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于2;⑧hefH mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.23±0.66和4.38±7.40,無(wú)顯著差異(P>0.05),但耐藥組R4、R10菌株表達(dá)量均高于12,敏感組所有菌株和其他MDR株表達(dá)量均低于3;⑨hefI mRNA的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.12±0.80和0.85±0.58,無(wú)顯著差異
13、(P>0.05),所有菌株的表達(dá)量均低于3;⑩HP1489的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.31±0.49和1.74±0.64,無(wú)顯著差異(P>0.05),所有菌株的表達(dá)量均低于5;?HP1488的相對(duì)表達(dá)量在敏感組和耐藥組分別為1.92±0.61和2.23±0.70,無(wú)顯著差異(P>0.05),所有菌株的表達(dá)量均低于5。
2、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)量與抗生素MIC的關(guān)系:AcrAB-TolC外排
14、泵11個(gè)相關(guān)蛋白編碼基因的表達(dá)量與5種H.pylori易產(chǎn)生耐藥抗生素的MIC均無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。
3、3種抗生素相關(guān)的特異性耐藥基因的檢測(cè):①8株對(duì)克拉霉素耐藥的H.pylori MDR株均存在23SrRNA突變,突變形式均為為A2143G;②10株對(duì)左氧氟沙星耐藥的H.pylori MDR株均存在gyrA突變,突變形式以261位堿基缺失為主,另有幾株存在G271A及A272G形式的突變;③10株對(duì)甲硝唑耐藥的H
15、.pyloriMDR株均存在rdxA和frxA突變,突變點(diǎn)散在分布,每株細(xì)菌的突變均影響了其翻譯的氨基酸序列。
4、外排泵抑制劑對(duì)H.pylori MDR株對(duì)抗生素敏感性的影響:①加入外排泵抑制劑PAβN后,10株H.pylori MDR株中有4株克拉霉素的MIC出現(xiàn)了4倍或4倍以上的變化;②加入外排泵抑制劑CCCP后,10株MDR株中有4株甲硝唑的MIC出現(xiàn)了4倍或4倍以上的變化,另有2株克拉霉素的MIC出現(xiàn)了4倍或4倍以上
16、的變化;③加入質(zhì)子泵抑制劑(奧美拉唑、泮托拉唑、蘭索拉唑、埃索美拉唑及雷貝拉唑)后,抗生素對(duì)MDR株的MIC未發(fā)生變化。
結(jié)論:
1、AcrAB-TolC外排泵相關(guān)蛋白編碼基因在部分臨床分離的H.pylori MDR株中存在高表達(dá),而所有臨床分離的H.pylori敏感株中未見(jiàn)高表達(dá),且外排泵抑制劑能降低部分抗生素對(duì)H.pylori MDR株的MIC,提示AcrAB-TolC外排泵在H.pylori多重耐藥中起一定作用
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