腸桿菌科細(xì)菌外排泵TolC功能研究.pdf

1、[目的]：
　　1.對(duì)五種腸桿菌科細(xì)菌（埃希菌屬、志賀菌屬、沙門(mén)菌屬、腸桿菌屬與克雷伯菌屬）TolC基因序列及蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，比較屬間相似性。
　　2.以大腸埃希菌TolC晶體結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)其余四個(gè)屬細(xì)菌的TolC進(jìn)行同源建模，并分析其空間構(gòu)象及參與外排泵裝配相關(guān)氨基酸位點(diǎn)的異同。
　　3.敲除大腸埃希菌E.coli DH5α的TolC基因;構(gòu)建五種腸桿菌科細(xì)菌TolC的組成性表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化E.coli DH

2、5α，使不同TolC基因在E.coli DH5α中表達(dá)，形成雜合AcrAB-TolC外排泵。通過(guò)比較攜帶不同TolC基因的E.coli DH5α對(duì)典型TolC底物的MIC，間接反應(yīng)雜合型AcrAB-TolC外排泵是否能夠成功裝配并形成具有功能的多耐藥外排泵。
　　[方法]：
　　1.TolC基因序列的比對(duì):根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)ClustalW2預(yù)測(cè)五種臨床常見(jiàn)腸桿菌科細(xì)菌TolC的同源性，比較屬間相似性。
　　2.同源建

3、模及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較:由于目前尚無(wú)其他腸桿菌科細(xì)菌TolC晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道，于是，我們采用Swiss-Model在線同源建模軟件，以大腸埃希菌的TolC晶體結(jié)構(gòu)作為模板，構(gòu)建其他四種細(xì)菌TolC的晶體結(jié)構(gòu);然后采用VMD軟件分析五種細(xì)菌的TolC的三維結(jié)構(gòu)及外排泵裝配關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，預(yù)測(cè)其他四種TolC與大腸埃希菌AcrB、AcrA裝配的的可能性。
　　3.E.coli DH5α TolC的敲除:采用Red同源重組系統(tǒng)（質(zhì)粒pKD46

4、），將擬敲除的TolC基因替換為一段兩端含有FRT位點(diǎn)的卡那霉素抗性基因。再通過(guò)pCP20質(zhì)粒表達(dá)的Flp重組酶，作用于FRT位點(diǎn)，消除抗性基因，從而完全敲除菌株體內(nèi)TolC基因。
　　4.TolC表達(dá)載體的構(gòu)建:采用HindⅢ與BspHI核酸內(nèi)切酶切除質(zhì)粒pTrc99A帶有的氨芐青霉素抗性啟動(dòng)子及其開(kāi)放閱讀框（open read frame，ORF），將五種TolC ORF插入到HindⅢ與BspHI酶切位點(diǎn)，使TolC基因的表

5、達(dá)位于啟動(dòng)子 Ptrc調(diào)控下，獲得TolC組成性表達(dá)載體。
　　5.最小抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）的測(cè)定:用微量肉湯稀釋法檢測(cè)MIC。挑選具有代表性的抗生素，將培養(yǎng)物與抗生素在96孔板中混勻，于37℃普通空氣孵箱中孵育16～20h后判斷結(jié)果。以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。
　　[結(jié)果]：
　　1.TolC基因序列的比對(duì):我們通過(guò)Clustal

6、 W2提供的在線序列比對(duì)，對(duì)這五種腸桿菌科細(xì)菌多重耐藥外排泵AcrAB-TolC的TolC進(jìn)行序列比對(duì)分析，比對(duì)了多種臨床常見(jiàn)腸桿菌科細(xì)菌TolC的同源性（埃希菌屬、志賀菌屬、沙門(mén)菌屬、腸桿菌屬與克雷伯菌屬），結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌與其他四個(gè)屬細(xì)菌TolC的核酸序列屬間同源性分別達(dá)到98％、82％、80％與78％，氨基酸序列屬間同源性分別達(dá)到99％、89％、84％與83％;除此之外，TolC與AcrB作用的關(guān)鍵位點(diǎn)氨基酸及其周?chē)蛄型耆恢?/p>

7、。另外，通過(guò)對(duì)其他四個(gè)屬細(xì)菌之間相互比較，發(fā)現(xiàn)其氨基酸序列的同源性也都在80％以上。
　　2.同源建模及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析:我們進(jìn)一步采用Swiss Model軟件，以大腸埃希菌TolC的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1EK9)作為模板進(jìn)行同源建模技術(shù)，獲得了其他四種細(xì)菌TolC的三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，這五種細(xì)菌的TolC出口端的形狀、各維度的尺寸等空間構(gòu)象參數(shù)相似性極高，且參與外排泵組裝的關(guān)鍵氨基酸所處的位置也極為相似。

8、
　　3.敲除E.coli DH5α的TolC:抗生素抗性及PCR檢測(cè)結(jié)果表明，E.coli DH5α的TolC基因被成功敲除。
　　4.構(gòu)建雜合AcrAB-TolC外排泵:成功構(gòu)建TolC的組成性表達(dá)載體，通過(guò)檢測(cè)MIC發(fā)現(xiàn)，志賀菌屬、沙門(mén)菌屬、腸桿菌屬與克雷伯菌屬的TolC均能與大腸埃希菌的AcrB-AcrA裝配成具有功能的雜合型外排泵。
　　5.MIC檢測(cè)結(jié)果:挑選五種具有代表性的物質(zhì)，脫氧膽酸鈉、氯霉素、四環(huán)素

9、、SDS、氨芐青霉素，采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)MIC。結(jié)果發(fā)現(xiàn):雜合型AcrAB-TolC與野生型AcrAB-TolC相比:①雜合型AcrAB-TolC的外排泵對(duì)五種物質(zhì)依舊耐藥;②敲除TolC基因的大腸埃希菌的MIC明顯降低;③沒(méi)有出現(xiàn)雜合型AcrAB-TolC MIC升高;④雜合型AcrAB-TolC與野生型AcrAB-TolC相比的MIC略有下降，但不具有顯著差異。
　　[結(jié)論]：
　　1.腸桿菌科細(xì)菌的TolC在基因與

10、氨基酸序列上具有較高的相似性，其空間構(gòu)象也極為相似，而且在與大腸埃希菌AcrB相互作用的氨基酸位點(diǎn)上也極為相似。
　　2.采用Red同源重組技術(shù)成功敲除E.coli DH5α的TolC基因，并成功構(gòu)建不同腸桿菌科細(xì)菌TolC基因的組成性表達(dá)載體。
　　3.通過(guò)檢測(cè)MIC值發(fā)現(xiàn)志賀氏菌、沙門(mén)氏菌、陰溝腸桿菌與肺炎克雷伯菌的TolC能與大腸埃希菌的AcrA-AcrB形成具有活性的雜合外排泵，表明腸桿菌科細(xì)菌的TolC基因可在上述