組合色譜柱法分離制備微囊藻毒素-RR及不同純度產(chǎn)物急性毒性研究.pdf

1、目的和意義：近年來，隨著水體富營養(yǎng)化程度加劇，我國水體藍藻水華暴發(fā)愈加頻繁，其中產(chǎn)毒藻種細胞死亡破裂后會釋放出藻毒素。最常見并獲得廣泛關(guān)注的是微囊藻毒素，其毒性巨大，嚴重危害動物及人類健康。有關(guān)該類毒素的毒性機制、病理學(xué)過程、防治措施對策、早期預(yù)警監(jiān)測等研究，都需要高質(zhì)量、足夠數(shù)量的純化毒素為前提才能實施進行。但是，該類毒素因其獨特的結(jié)構(gòu)組成與眾多的同系物，尚無法人工合成制備，只能從天然樣品分離、提取與純化。因此，獲取微量的毒素需要巨大

2、的資金投入與強大的技術(shù)支撐。高昂的毒素成本限制了該領(lǐng)域很多科學(xué)研究進一步的拓展與深入。例如，我國微囊藻毒素污染主要以微囊藻毒素-RR（MC-RR）為主，但其商品價格幾乎是微囊藻毒素-LR（MC-LR）的2倍，所以，有關(guān)MC-RR的研究報道遠遠少于MC-LR。另外，天然樣品除了細胞毒素含量微量外，后期純化還存在多種微囊藻毒素同系物混合不易分離的技術(shù)難題。我們前期工作發(fā)現(xiàn)以MC-RR含量為主的天然藍藻粗提物，含有MC-LR和MC-YR等同系

3、物，通過反相固相柱萃取、分子篩層析柱處理后，MC-RR純度可達90％左右，但是只能實現(xiàn)MC-RR相對純化，不能有效將其與MC-LR分離。
　　針對上述問題，本文在前期課題研究基礎(chǔ)上重點探索了如何以MC-RR含量為主的天然水華藍藻為材料，從粗提、分離至純化的各種工藝組合、參數(shù)優(yōu)化，最終實現(xiàn)MC-RR有效分離及高度純化，并對不同階段提取成分的生物學(xué)急性毒性變化進行了研究。為今后深入開展亞急性、慢性毒理學(xué)研究和基礎(chǔ)病理生化研究提供充分的

4、技術(shù)儲備與科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　實驗方法：利用浮游生物網(wǎng)采集中山公園水華藍藻，通過對比不同比例甲醇-水溶液，不同提取方法（70%甲醇-水溶液提取、微波提取、沸水浴）的效果，擇優(yōu)一種粗提方法。將獲得的粗提液通過調(diào)節(jié)pH、離心、過濾除去藻藍蛋白，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇。然后根據(jù)反相固相萃取柱的疏水性、Sephadex LH-20的分子篩特性和 DEAE纖維素（DEAE-C）離子交換特性原理進行不同組合，對粗提物反復(fù)進行濃縮分離、稀釋分離、再濃縮分

5、離多次純化過程，探索最佳的MC-RR純化方法。最后利用高效液相色譜（HPLC）對純化得到的樣品進行檢測和鑒定。
　　分別用改良寇氏法和序貫法給昆明小鼠染毒研究微囊藻毒素粗提液及不同純度MC-RR的腹腔注射和經(jīng)口的急性毒性，記錄小鼠染毒后活動狀態(tài)，死亡時間，各組死亡和存活數(shù)，根據(jù)公式計算LD50；對死亡小鼠立即解剖取出心肝腎臟器，觀察形態(tài)改變，然后稱重計算臟器系數(shù)。再取部分組織、固定、石蠟包埋及 HE染色，鏡下觀察組織細胞結(jié)構(gòu)改變。

6、
　　結(jié)果：提取條件的優(yōu)化結(jié)果：70%的甲醇-水溶液提取效果最佳，5g藻漿中可以獲得150μg MC-RR；對比三種破碎細胞的方法，其中70%甲醇-水溶液磁力攪拌的效果最好，從8g藻漿可以提取出258.60μg MC-RR和80.86μg MC-LR，而微波提取法只能獲得125.10μg MC-RR和30.02μg MC-LR，沸水浴提取法只能得到108.75μg MC-RR和24.70μg MC-LR；提取液體積與藻漿質(zhì)量最佳比

7、例（v:m）為10:1。
　　固相萃取條件優(yōu)化結(jié)果：對比不同的固相萃取柱富集效果，其加標回收率沒有顯著性差異，但HLB固相萃取柱操作方便且更加省時，本實驗選擇HLB固相萃取柱對樣本進行富集；加入0.5%三氟乙酸（TFA）的甲醇洗脫液效果明顯優(yōu)于純甲醇洗脫液；洗脫體積與次數(shù)為3 mL、一次性洗脫。
　　最終純化方案選擇：70%甲醇-水溶液提取—調(diào)節(jié)pH沉淀蛋白—旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)—固相萃取—Sephadex LH-20過柱—DEAE-C

8、過柱。該純化方案效果較好，可以同時獲得MC-RR和 MC-LR，其純度均大于95%，并有效將二者分離，得率分別為81.13%和36.21%。
　　急性毒性實驗結(jié)果：小鼠經(jīng)腹腔注射，85%純度MC-RR的LD50=137.20μg/kg，95%置信區(qū)間為118.69～158.60μg/kg；95%純度MC-RR的LD50=142.18μg/kg，95%置信區(qū)間為123.63~163.52μg/kg；微囊藻毒素粗提液的LD50=2.7

9、27mg/kg，95%置信區(qū)間為2.347～3.168mg/kg。實驗均呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，與對照組相比染毒組肝臟系數(shù)增加，腎臟和心臟系數(shù)沒有顯著性變化，組織病理學(xué)可見肝細胞細胞排列紊亂、壞死，肝竇充血，腎臟和心臟組織病理學(xué)未見明顯異常。微囊藻毒素粗提液經(jīng)口染毒 LD50=133.9mg/kg，95%置信區(qū)間為（130.6~137.2mg/kg）。
　　結(jié)論：采用70%甲醇對野外采集的水華藍藻進行提取，經(jīng)蛋白沉淀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，固相萃取

10、后，先利用Sephadex LH-20凝膠柱進行初步分離純化，再利用DEAE-C柱進行純化，可以將MC-RR和MC-LR兩種藻毒素分開，其純度均大于95%，是實驗室小量制備MC-RR的可靠方法。微囊藻毒素-RR經(jīng)小鼠腹腔注射和經(jīng)口急性毒性主要表現(xiàn)為肝臟毒性，未見其他器官毒性。其中，經(jīng)腹腔注射：85%純度MC-RR和95%純度MC-RR毒性相當，但略高于商品MC-RR標準品毒性；粗提液毒性遠遠低于85%純度MC-RR和95%純度MC-RR