微囊藻毒素-RR對(duì)小鼠水代謝和神經(jīng)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一部分 微囊藻毒素-RR持續(xù)暴露導(dǎo)致小鼠水代謝異常機(jī)制研究
　　目的：探究微囊藻毒素-RR（MC-RR）連續(xù)染毒對(duì)小鼠水代謝的影響及主要作用機(jī)制。方法：第一階段：將28只6~7周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，連續(xù)腹腔注射MC-RR(A:140μg/kg，B:70μg/kg，C:35μg/kg，D:0μg/kg)30天，每天記錄小鼠的體重、飲水量和尿量，30天后觀察小鼠肝臟、腎臟的損傷

2、情況，檢測(cè)肝組織血管緊張素原（AGT）基因的表達(dá)水平。第二階段：建立在第一階段的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上。將56只6~7周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠隨機(jī)分為8組，每組7只。其中四組連續(xù)腹腔注射MC-RR(A:140μg/kg，B:70μg/kg，C:35μg/kg，D:0μg/kg)30天后停止染毒，繼續(xù)觀察至42天，記錄小鼠每天的飲水量、尿量和體重變化，42天后檢測(cè)小鼠肝臟損傷情況以及體內(nèi)RAS水平；另外四組小鼠連續(xù)腹腔注射染毒至60天，每天觀察延長(zhǎng)染

3、毒期間各組小鼠的飲水量、尿量和體重的變化，60天后檢測(cè)各染毒劑量組小鼠肝臟、腎臟的組織病理學(xué)變化、血清生化酶等指標(biāo)。第三階段：將168只6~7周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，劑量同上，染毒28天，停藥后繼續(xù)觀察至42天，在此過(guò)程中將染毒第7、14、21、28、35和42天設(shè)置為取樣時(shí)間點(diǎn)，每組每次取樣量為n=7，檢測(cè)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各個(gè)染毒劑量組小鼠的組織病理學(xué)變化、臟器系數(shù)、尿比重、尿電解質(zhì)、尿微量白蛋白、血清生化酶、血清RAS水平、

4、血清AVP濃度等指標(biāo)。第四階段：將28只6~7周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，用腎素血管緊張素系統(tǒng)（RAS）阻斷劑阿利吉侖（aliskiren）和MC-RR聯(lián)合染毒驗(yàn)證由前三個(gè)實(shí)驗(yàn)階段結(jié)果得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)論，注射劑量分別為140μg/kg MC-RR、140μg/kg MC-RR+100mg/kg阿利吉侖、140μg/kg MC-RR+50mg/kg阿利吉侖、生理鹽水，連續(xù)腹腔注射30天，每天記錄各劑量組小鼠的飲水量和尿量，第30天對(duì)

5、小鼠體內(nèi)RAS水平進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：（1）140μg/kg MC-RR劑量組在染毒第9天起飲水量和尿量增加，隨著染毒時(shí)間的積累，與對(duì)照組飲水和尿量的差別逐漸加大，在染毒第30天時(shí)高劑量組尿量約為對(duì)照組的5倍，飲水量約為2倍；染毒停止后，140μg/kg MC-RR劑量組小鼠尿量在一周內(nèi)恢復(fù)到對(duì)照組水平；60天延長(zhǎng)染毒實(shí)驗(yàn)中，140μg/kg組小鼠的飲水和尿量持續(xù)升高至30天，然后進(jìn)入第一個(gè)平臺(tái)期（尿量為0.21~0.25ml/

6、g/day，飲水量為0.51~0.60ml/g/day），在染毒第43天時(shí)飲水和尿量再次升高，并進(jìn)入第二個(gè)平臺(tái)期（尿量為0.25~0.32ml/g/day，飲水量為0.60~0.68ml/g/day），持續(xù)至染毒結(jié)束。（2）140μg/kg MC-RR劑量組小鼠體重增長(zhǎng)明顯低于對(duì)照組，肝臟損傷明顯，主要表現(xiàn)為：與對(duì)照組比較，肝臟臟器系數(shù)值增大（P<0.05），組織病理學(xué)觀察可見(jiàn)肝細(xì)胞腫脹，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血清ALT、AST、ALP等酶學(xué)指

7、標(biāo)呈時(shí)間依賴(lài)性升高，然而在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未觀察到明顯的腎臟損傷：腎臟組織病理學(xué)觀察未見(jiàn)異常，BUN、CREA、UA、尿微量白蛋白（mALB）、尿電解質(zhì)等指標(biāo)未見(jiàn)病理性異常變化。（3）140μg/kg MC-RR染毒組小鼠肝臟血管緊張素原（AGT）mRNA表達(dá)水平上調(diào)至對(duì)照組水平的1.5倍左右（P<0.05），同時(shí)血清RAS標(biāo)志物濃度呈時(shí)間依賴(lài)性升高，并與肝臟損傷指標(biāo)的變化趨勢(shì)相一致。血清AVP檢測(cè)值也增高。（4）停止染毒后，MC-RR引

8、起的多飲、多尿、增高的RAS標(biāo)志物水平和肝臟損傷在一至兩周內(nèi)陸續(xù)恢復(fù)到對(duì)照組水平；100mg/kg劑量的RAS阻斷劑（阿利吉侖）可幾乎完全抑制140μg/kg MC-RR引起的多飲，多尿以及體內(nèi)增高的RAS標(biāo)志物水平，在不同阻斷劑量下呈現(xiàn)典型劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　結(jié)論：在非致死較高劑量持續(xù)暴露下，MC-RR可以通過(guò)肝臟損傷引起昆明小鼠體內(nèi)RAS級(jí)聯(lián)水平升高，最終導(dǎo)致多飲、多尿等水代謝異常。
　　第二部分 微囊藻毒素-RR對(duì)小鼠

9、神經(jīng)行為的影響及機(jī)制初探
　　目的：實(shí)驗(yàn)觀察微囊藻毒素-RR（MC-RR）重復(fù)染毒對(duì)小鼠神經(jīng)行為的影響，并初步探究可能的作用機(jī)制。
　　方法：28只6~7周齡SPF級(jí)雄性昆明小鼠隨機(jī)分為4組，連續(xù)腹腔注射染毒MC-RR(A:140μg/kg，B:70μg/kg，C:35μg/kg，D:0μg/kg)7天，染毒3天開(kāi)始水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，第7天進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)。染毒結(jié)束后透射電鏡觀察實(shí)驗(yàn)小鼠大腦皮層血腦屏障超微結(jié)構(gòu)的改變，

10、免疫組化和液質(zhì)方法檢測(cè)染毒小鼠腦組織中MC-RR的積累，高效液相熒光方法檢測(cè)腦組織中四種氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)的含量，熒光定量法比較Oatp家族在小鼠腦組織和肝臟中基因的mRNA表達(dá)種類(lèi)和表達(dá)量的差異。
　　結(jié)果：140μg/kg MC-RR染毒7天可致昆明雄鼠自發(fā)活動(dòng)增強(qiáng)，但未觀察到對(duì)小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響；140μg/kg MC-RR劑量組小鼠大腦皮層毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)出胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹；免疫組化分析結(jié)果可見(jiàn)小

11、鼠大腦皮層細(xì)胞中MC-RR的積累量隨著染毒劑量的提高逐漸增多，MMPB氧化還原-液質(zhì)檢測(cè)法在各劑量組均未檢測(cè)到MC-RR；高劑量MC-RR可引起腦組織中四種氨基酸類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量升高：谷氨酸，天冬氨酸，甘氨酸，γ-氨基丁酸，分別達(dá)到7.79±2.40mg/kg，4.30±0.67mg/kg，2.30±0.67mg/kg，1.30±0.19mg/kg，且與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而另外兩個(gè)劑量組與對(duì)照組比，腦組織中四種氨

12、基酸的含量雖有增高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；熒光定量PCR方法檢測(cè)到小鼠腦組織中Oatp1c1、Oatp3a1、Oatp1a4基因的mRNA表達(dá)水平較高，Oatp1a1、Oatp1b2、Oatp2b1、Oatp2a1、Oatp1a5這些在肝組織中mRNA表達(dá)水平較高的Oatps在腦組織中也有不同程度的表達(dá)。
　　結(jié)論：MC-RR可能通過(guò)Oatps轉(zhuǎn)運(yùn)到小鼠大腦皮層，引起線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)的破壞，神經(jīng)遞質(zhì)的異常釋放，最