膳食中不同n-6-n-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響及分子機(jī)制研究.pdf

1、“膳食、營養(yǎng)與腫瘤”是多學(xué)科交叉的熱門研究領(lǐng)域，人們發(fā)現(xiàn)多種膳食營養(yǎng)因素與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。在過去的幾十年中，有關(guān)膳食脂肪與腫瘤的關(guān)系一直倍受關(guān)注，研究人員發(fā)現(xiàn)了諸多有力證據(jù)支持膳食脂肪攝入能影響到上皮源性或激素相關(guān)的乳腺癌、前列腺癌、大腸癌、卵巢癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。進(jìn)一步研究證實(shí)，飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)和多不飽和脂肪酸(PUFAs)對(duì)乳腺癌發(fā)生存在差異性，而PUFAs的含量與構(gòu)成有著更

2、為復(fù)雜而重要的作用，如n-6PUFA可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和腫瘤的發(fā)生，n-3PUFA卻有抗腫瘤及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。 目前，有關(guān)n-6PUFA和n-3PUFA影響乳腺癌發(fā)生差異性的分子機(jī)制尚不完全清楚。而有研究提示，脂肪組織中的n-6/n-3PUFA比例而非這些脂肪酸單一濃度與乳腺癌發(fā)生更為密切相關(guān)。如Simopoulos指出，膳食中n-6/n-3PUFA最佳比例可因疾病的不同而有所改變，低比例的n-6/n-3PUFA能降低

3、慢性疾病如惡病質(zhì)的發(fā)生。但至今尚不清楚膳食中攝入的n-6PUFA和n-3PUFA達(dá)何種比例才能有效預(yù)防乳腺癌的發(fā)生?當(dāng)前，我國國人的膳食脂肪攝入主要以n-6PUFA(葵花籽油、豆油、玉米油等)為主，只有微量的n-3PUFA攝入，導(dǎo)致n-6PUFA與n-3PUFA的比值較高，且近年來我國乳腺癌發(fā)病率呈逐年升高的趨勢(shì)，尤其在經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)地區(qū)和部分大城市。因此，深入研究膳食脂肪，以及n-6/n-3PUFA不同膳食構(gòu)成比與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及其分

4、子機(jī)制，對(duì)從膳食途徑預(yù)防乳腺癌具有重要意義。 眾所周知，細(xì)胞膜是細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的屏障，細(xì)胞增殖活化有關(guān)或相伴的“早期事件”及“后續(xù)事件”的發(fā)生都與膜的正常結(jié)構(gòu)與功能有關(guān)。作為兩種重要的膳食脂肪酸，n-6PUFA和n-3PUFA與細(xì)胞膜脂有極高的親合性，并直接參與膜脂構(gòu)成，而膜脂結(jié)構(gòu)對(duì)維持膜功能(如膜電位、膜通透性、細(xì)胞間通訊功能)，及細(xì)胞的增殖分化起十分重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，n-6PUFA和n-3PUFA可調(diào)節(jié)膜磷脂酶活性，影響花

5、生四烯酸(AA)衍生物的形成，發(fā)揮促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長的作用。且細(xì)胞膜脂肪酸結(jié)構(gòu)或性質(zhì)的改變能影響膜流動(dòng)性、膜連接酶、受體或離子通道等功能。此外，細(xì)胞膜上由脂筏和膜穴樣內(nèi)陷形成的膜脂微區(qū)，連接著許多關(guān)鍵性的信號(hào)蛋白(IGF-lR、Ha-Ras、G蛋白、Src激酶等)。研究提示，n-6PUFA和n-3PUFA對(duì)膜脂微區(qū)的影響不同。由此，我們推測(cè)n-6PUFA和n-3PUFA可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂結(jié)構(gòu)和功能(如影響膜脂流動(dòng)性、膜電位、膜通訊功能、

6、膜蛋白的活化等)，作用于后續(xù)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮促癌或抗癌效應(yīng)。 基于以上分析，本研究結(jié)合人們?nèi)粘Ｉ攀程攸c(diǎn)，利用體內(nèi)化學(xué)致癌劑誘導(dǎo)的動(dòng)物乳腺癌模型和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，采用了諸如共聚焦顯微鏡技術(shù)、單細(xì)胞離子跨膜流動(dòng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)技術(shù)、熒光探針標(biāo)記、劃痕染料示蹤技術(shù)，以及RT-PCR、Westernblotting等先進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，深入研究了不同膳食脂肪酸，尤其是n-6/n-3PUFA不同構(gòu)成比與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及可能分子機(jī)制。首先，

7、實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建MNU誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌模型，從體內(nèi)系統(tǒng)觀察攝入SFA、MUFA、n-6PUFA、n-3PUFA，以及不同膳食脂肪酸構(gòu)成比(1∶1n-6/n-3PUFA、5∶1n-6/n-3PUFA、10∶1n-6/n-3PUFA、1∶2∶1S/M/P)對(duì)大鼠乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響，并從乳腺組織脂肪酸組成、脂質(zhì)代謝調(diào)控關(guān)鍵基因表達(dá)及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的改變等深入研究可能分子機(jī)制。進(jìn)而結(jié)合雌激素受體陽性(positiveestrogenreceptor

8、，ER+)MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系和雌激素受體陰性(ER-)的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞系，從體外重點(diǎn)探討n-6/n-3PUFA不同構(gòu)成對(duì)兩種乳腺癌細(xì)胞膜脂組成變化、膜生物物理特性和膜功能的影響，深入揭示膜脂構(gòu)成及功能改變?cè)谟绊懭橄侔┌l(fā)生、發(fā)展中的作用。 本研究主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1.采用甲基亞硝基脲(MNU)一次性腹腔注射給藥，在清潔級(jí)SD雌性大鼠體內(nèi)成功復(fù)制大鼠乳腺癌模型，經(jīng)病理組織學(xué)檢查確認(rèn)誘發(fā)的乳腺腫瘤為乳

9、腺導(dǎo)管癌。研究發(fā)現(xiàn)，不同膳食脂肪酸及其構(gòu)成對(duì)MNU誘導(dǎo)的大鼠乳腺癌發(fā)生的影響不同，SFA、MUFA、n-6PUFA、5∶1n-6/n-3PUFA、10∶1n-6/n-3PUFA和1∶2∶1S/M/P有較高的乳腺癌誘發(fā)率(10～12/13，83.33％～92.31％)、多發(fā)率和癌細(xì)胞增殖活性，1∶1n-6/n-3PUFA組大鼠乳腺癌發(fā)生(6/14，42.86％)和癌細(xì)胞增殖能力明顯降低，而單純n-3PUFA喂養(yǎng)動(dòng)物在本研究設(shè)定實(shí)驗(yàn)期內(nèi)未誘

10、發(fā)出乳腺癌，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)單純喂養(yǎng)n-3PUFA一定時(shí)間后，大鼠食欲減退，生長發(fā)育明顯滯后。鑒于n-6PUFA和n-3PUFA在體內(nèi)同樣具有重要的生理功能，本研究提示，n-6PUFA和n-3PUFA之間的1∶1平衡攝入較高比例攝入n-6PUFA或單一其它種類脂肪酸對(duì)預(yù)防乳腺癌更為有益。 2.發(fā)現(xiàn)不同膳食脂肪酸可導(dǎo)致大鼠乳腺組織脂肪酸含量及構(gòu)成發(fā)生明顯變化，其變化趨勢(shì)與膳食脂肪組成基本一致。高乳腺癌誘發(fā)組大鼠的乳腺組織含有較多的C18

11、∶1、C18∶2和C20∶4，而EPA和DHA含量極少；但在無或低乳腺癌誘發(fā)的n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA喂養(yǎng)組，乳腺組織EPA和DHA明顯多于高乳腺癌誘發(fā)組，C20∶4含量顯著減少，推測(cè)其抑癌效應(yīng)可能與乳腺組織內(nèi)EPA和DHA蓄積增多，在部分替代C20∶4的同時(shí)，減少C20∶4及衍生物合成并拮抗其生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)而阻止細(xì)胞惡性增生相關(guān)。乳腺組織n-6PUFA和n-3PUFA相對(duì)構(gòu)成比可能是影響乳腺癌發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。

12、 3.發(fā)現(xiàn)在MNU誘癌模型組，喂養(yǎng)n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA的大鼠乳腺組織脂代謝調(diào)控基因FAS、COX-2、5-LOX和PPARsmRNA表達(dá)明顯低于高乳腺癌誘發(fā)組，并伴有胞內(nèi)MAPK蛋白活性降低，提示，乳腺組織脂肪酸構(gòu)成的改變可從多角度將脂代謝關(guān)鍵基因FAS、COX-2、5-LOX和PPARs串聯(lián)起來，形成一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，通過與胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相互作用，影響大鼠乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。 4.體外研究顯示，以終

13、濃度為150μmol/L的n-6PUFA、n-3PUFA及不同n-6/n-3PUFA構(gòu)成(1∶1，5∶1和10∶1，脂肪酸終濃度也為150μmol/L)處理MCF-7(ER+)和MDA-MB-231(ER-)兩種人乳腺癌細(xì)胞，細(xì)胞增殖功能改變，n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA能有效抑制兩種乳腺癌細(xì)胞生長，且ER-的MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞較ER+的MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)脂肪酸處理更為敏感。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中n-6

14、/n-3PUFA不同構(gòu)成明顯改變細(xì)胞膜脂組成：促乳腺癌細(xì)胞增殖的n-6PUFA和10∶1n-6/n-3PUFA處理組細(xì)胞膜較對(duì)照組含有更多的C18∶2和C20∶4，且無n-3PUFA蓄積；但抑制乳腺癌細(xì)胞生長的n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA處理組細(xì)胞膜EPA含量顯著增加，同時(shí)未檢測(cè)到C20∶4，表明其抗癌作用可能與EPA含量增高，減少C20∶4合成并抑制其生物學(xué)效應(yīng)有關(guān)。該發(fā)現(xiàn)與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很好的一致性。提示，細(xì)胞膜適

15、當(dāng)?shù)膎-6/n-3PUFA含量是抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖的重要分子機(jī)制之一。 5.發(fā)現(xiàn)不同脂肪酸誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的細(xì)胞膜脂構(gòu)成改變能導(dǎo)致細(xì)胞膜生物物理特性和膜功能的變化：n-6PUFA和10∶1n-6/n-3PUFA促癌組可誘導(dǎo)兩種乳腺癌細(xì)胞膜去極化、細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流、連接蛋白(Cxs)表達(dá)下調(diào)；而n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA抑癌組則導(dǎo)致細(xì)胞膜超極化改變，減緩細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流并上調(diào)Cxs表達(dá)，提示，n-3PUFA和1

16、∶1n-6/n-3PUFA可能通過增加細(xì)胞膜EPA含量，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂結(jié)構(gòu)和功能而發(fā)揮抗癌效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)同時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞培養(yǎng)介質(zhì)中n-6/n-3PUFA不同構(gòu)成雖影響細(xì)胞膜脂結(jié)構(gòu)和膜功能，但對(duì)癌細(xì)胞的GJIC功能無明顯作用，推測(cè)n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA的抗癌作用可能獨(dú)立于GJIC的調(diào)節(jié)機(jī)制。 6.發(fā)現(xiàn)n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA能降低ER+的MCF-7和ER-的MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞脂代謝基

17、因(COX-2、5-LOX和PPARs)mRNA表達(dá)，阻止胞內(nèi)MAPK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。表明細(xì)胞膜脂構(gòu)成改變導(dǎo)致的細(xì)胞膜功能、脂代謝基因和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的不同變化及其相互影響，是n-6/n-3PUFA不同構(gòu)成差異性調(diào)控人乳腺癌細(xì)胞生長的重要分子機(jī)制。 綜上所述，本課題從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明不同膳食脂肪酸和n-6/n-3PUFA不同構(gòu)成比對(duì)大鼠乳腺癌發(fā)生、發(fā)展影響是不同的，n-6PUFA和n-3PUFA之間的1∶1平衡攝入較高比例攝入n-6PU

18、FA或單一其它種類脂肪酸對(duì)預(yù)防乳腺癌更為有益。同時(shí)體外研究也發(fā)現(xiàn)，單一n-6PUFA和高比例的n-6/n-3PUFA對(duì)體外乳腺癌細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用，而n-3PUFA和1∶1n-6/n-3PUFA則能有效抑制乳腺癌細(xì)胞生長。上述效應(yīng)可能與不同脂肪酸使乳腺組織或乳腺癌細(xì)胞膜n-6PUFA和n-3PUFA相對(duì)構(gòu)成比發(fā)生差異性改變，進(jìn)而影響到膜生物物理特性和膜功能，以及細(xì)胞跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。同時(shí)，該項(xiàng)研究從膳食營養(yǎng)途徑預(yù)防乳腺癌提供了重要理