arresten抑制血管生成的作用機制及arresten基因轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用研究.pdf

1、背景：眾所周知,惡性腫瘤最重要的生物特性是侵襲和轉(zhuǎn)移,這也是腫瘤病人的主要臨床致死原因。據(jù)不完全統(tǒng)計,約70[％]的腫瘤病人在臨床確診時已經(jīng)存在腫瘤轉(zhuǎn)移。尤其是死亡率占前幾位的腫瘤,如肺癌,胃癌,肝癌等,臨床病人確診時,往往已經(jīng)處于中晚期,通常腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,常規(guī)臨床治療效果不佳,死亡率極高。早在1971年，F(xiàn)olkman首先發(fā)現(xiàn)了腫瘤血管形成因子(TAF)，并認(rèn)為抑制腫瘤血管生成(angiogenesis)能有效的抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)

2、移和復(fù)發(fā)。目前這一觀點已經(jīng)得到廣泛的證實。近年的研究表明，實體腫瘤生長至1ｍｍ3以上時即需要新生血管形成；否則腫瘤停止生長,靜止于休眠狀態(tài)(dormantstate),瘤體維持在2～3ｍｍ3以內(nèi),細(xì)胞數(shù)在107以內(nèi)；并且腫瘤維持在原位(insitu)達(dá)數(shù)月或數(shù)年,不會發(fā)生轉(zhuǎn)移。而一旦腫瘤細(xì)胞獲得血管生成表型(angiogenicphenotype),便可誘導(dǎo)血管生成,腫瘤建立起新生血管網(wǎng),從而促進(jìn)腫瘤快速生長,其轉(zhuǎn)移潛能也迅即出現(xiàn)。因此

3、,抗血管生成,切斷腫瘤惡性生長的供養(yǎng)途徑,并阻斷腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的血行通道,致使腫瘤靜止于休眠狀態(tài),可有效遏制腫瘤的惡性行為,是治療腫瘤的有效策略。目前，血管生成抑制劑的研究主要有如下4種策略：(1)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞降解周圍基質(zhì)的能力；(2)直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞的功能；(3)阻斷血管生成因子的合成和釋放，拮抗其作用；(4)阻斷內(nèi)皮細(xì)胞表面整合素的作用。
　　 Arresten是Colorado等發(fā)現(xiàn)的一種強效的血管生成抑制因子，它屬于Ⅳ型膠

4、原α1鏈的羧基末端NC1結(jié)構(gòu)域多肽片段，其分子量為26kd。研究發(fā)現(xiàn)，arresten抑制血管生成的作用顯著強于內(nèi)皮素，而且其蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，因此有望成為腫瘤血管生成抑制劑。本課題組在先前的研究中，對原核表達(dá)的arresten抑制血管生成作用進(jìn)行了一些探討。原核表達(dá)雖產(chǎn)量高，但產(chǎn)物的重復(fù)性差、活性低，而中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)是目前常用的真核表達(dá)體系，它可較長時間地表達(dá)所攜帶的基因而不衰減，并能穩(wěn)定地大量表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)具有

5、糖基化、磷酸化等修飾，具有良好的生物活性，因此被廣泛用于蛋白表達(dá)和疫苗生產(chǎn)。本研究通過CHO細(xì)胞株真核表達(dá)并純化arresten蛋白，探討其抑制血管生成的分子生物學(xué)機制，并觀察arresten基因轉(zhuǎn)染對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用。
　　 目的：建立arresten的真核表達(dá)體系，獲得純化的arresten蛋白；觀察arresten對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管腔形成的影響，了解其對內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞黏附的影響；并探討其相關(guān)的分子

6、生物學(xué)機制；觀察arresten基因轉(zhuǎn)染對裸鼠實驗性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制效果，探討arresten在腫瘤轉(zhuǎn)移治療中的應(yīng)用前景。
　　 方法：用脂質(zhì)體Lipofectamine2000通過基因轉(zhuǎn)染將arresten基因?qū)隒HO細(xì)胞，建立arresten蛋白的真核表達(dá)體系，經(jīng)過純化獲得arresten蛋白；觀察arresten對huvec細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞黏附和管腔形成的影響；應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等實驗方法，

7、檢測VEGF和VCAM-1的表達(dá)；通過基因轉(zhuǎn)染將arresten基因?qū)虢Y(jié)腸癌LOVO細(xì)胞株，建立裸鼠實驗性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的模型，觀察arresten基因轉(zhuǎn)染對腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用，F(xiàn)ⅧRag多克隆抗體染色的免疫組化方法檢測腫瘤組織的微血管密度(MVD)，進(jìn)一步證實arresten抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用途徑。
　　 結(jié)果：RT-PCR及Western-blot證實arresten成功導(dǎo)入CHO細(xì)胞并在mRNA及蛋白水平高表達(dá)，表明成功建

8、立arresten的真核表達(dá)體系，經(jīng)過純化得到arresten蛋白。體外實驗表明，arresten能抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而抑制血管腔形成，而其相關(guān)作用機制可能與arresten降低huvec細(xì)胞的VEGF表達(dá)有關(guān)。Arresten還能通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的黏附。體內(nèi)實驗表明，arresten基因轉(zhuǎn)染能抑制實驗性裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤血管生成是其作用途徑。
　　 結(jié)論：arres